安胃湯干預(yù)肝郁脾虛證胃潰瘍大鼠胃竇組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究

朱梓銘 唐友明 吳德坤 陳夏 韓葉芬 牛豫杰 鄭景輝

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧 530001）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院（南寧 530011）

胃潰瘍，屬于中醫(yī)腹痛、胃脘痛、痞滿的范疇，其中氣郁傷肝，肝失條達，橫逆犯胃為主要病機的肝郁脾虛型胃潰瘍是其中常見的證型。安胃湯是在全國名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性胃病的驗方基礎(chǔ)上組方而成，方中白芍柔肝健脾止痛，配以柴胡、烏藥疏肝解郁止痛，合半夏入胃，更能和胃降逆，燥濕開結(jié)，通降氣機；薏苡仁健脾除濕；少佐黃連瀉火解毒，干姜溫中逐寒，寒熱同施，辛開苦降；配合百合、炙甘草，則養(yǎng)津護胃，酸甘化陰以生津液，臨床療效顯著。但是，現(xiàn)階段中醫(yī)藥治療胃潰瘍的研究仍存在研究深度不夠，缺乏對指標間相互關(guān)聯(lián)探索的問題［1］。為此，本課題組采用蛋白組學(xué)與生物信息學(xué)分析的手段，從機體、組織或細胞等不同層次的“整體”蛋白質(zhì)活動的角度，揭示安胃湯治療肝郁脾虛型胃潰瘍大鼠的分子機制，力求更深入地探究中藥多靶點在生物分子層面的作用與聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物Wistar雄性大鼠45只，體質(zhì)量130～170 g。實驗過程中對動物處置符合科學(xué)技術(shù)部關(guān)于發(fā)布《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（國科發(fā)財字〔2006〕398號）的要求。動物許可證號：SCXK（桂）2014-0002。

1.1.2藥物安胃湯藥物組成：半夏（Pinellia ternata）13 g，黃連（Coptis chinensis）5 g，干姜（Zingiber officinale）5 g，烏藥（Lindera aggregata）7 g，丹參（Salvia miltiorrhiza）15 g，百合（Lilium brownii）20 g，白芍（Paeonia lactiflora pall）20 g，薏苡仁（Semen coicis）10 g，炙甘草（Glycyrrhiza uralensis）5 g。其制劑制備由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥制劑室提供。鑒定人為唐友明（主任醫(yī)師，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院）。

1.1.3主要試劑M-PER蛋白提取試劑盒（批號KGP2100南京凱基生物有限公司），Bradford蛋白濃度測定試劑盒（貨號WB013西安赫特生物科技有限公司），蛋白分子量Marker（批號DM111-01北京全式金生物有限公司），質(zhì)譜級胰蛋白酶（P8101-22S美國Pierce），iTRAQ 4-plex標記試劑盒及緩沖液（批號4381557美國AB Sciex）。

1.1.4主要儀器Agilent 1100 seriesⅡ色譜分離系統(tǒng)（美國Agilent），TempoTMLC MALDI高效液相色譜儀（美國SCIEX），5800 Plus MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析儀（美國SCIEX），Zorbax Bio-SCX SeriesⅡ強陽性離子交換柱（美國Agilent），C18 spin column除鹽柱（The Nest Group公司），Magic C18 AQ反相柱（美國Michrom Bioresources），ProteinPilot 2.0軟件（美國SCIEX）。

1.2方法

1.2.1模型建立及切片制備

1.2.1.1模型的建立及分組給藥將45只清潔型大鼠隨機分為正常組、模型組和安胃湯組，每組15只，正常組每日上午3 mL生理鹽水灌服，自由飲食，共14 d；模型組與安胃湯組大鼠以多因素復(fù)合模擬中醫(yī)病因并結(jié)合乙酸法建立模型［2］：（1）每日上午以每只3 mL灌服大黃制劑液；（2）每日上午以木夾夾大鼠尾中部每只30 min；（3）每日下午將動物負重：于大鼠尾根部纏繞重量為該大鼠體質(zhì)量10%的保險絲，放入水深50 cm，水溫28℃的水槽中游泳，以力竭為度，即大鼠鼻尖沒入水面10 s。共14 d。自由飲食；（4）第15天禁食，于禁食24 h后，水合氯醛麻醉下施行剖腹術(shù)，打開腹腔，暴露胃體，在富有腺體的部位注射50%的冰乙酸0.05 mL，針頭與注射部位呈15°，回納胃體，關(guān)閉腹腔。禁食，不禁水。造模成功后第3天開始給藥治療。安胃湯組大鼠以成人等效劑量的6.17倍灌服［2］。正常組與模型組大鼠予等量生理鹽水灌胃。給藥21 d后，予以處死大鼠取胃竇組織。

1.2.1.2樣本病理切片制備將胃竇組織經(jīng)甲醛固定，逐級脫水、石蠟浸蠟包埋、連續(xù)切片和脫蠟，HE染色，封片，進行組織形態(tài)學(xué)觀察，作病理學(xué)診斷。

1.2.2組織樣本同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

1.2.2.1蛋白制備及蛋白濃度測定在兩組離心管中各加入1 mg/mL BSA蛋白標準溶液各0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，然后再分別加入無離子水分別為100、97.5、95、92.5、90、87.5、85 μL，混勻，配制成一系列不同濃度的BSA溶液。各管均加入Bradford工作液1 mL，混勻，靜置3 min后測定A595值，重復(fù)3次，取其平均值。以BSA蛋白量0～15 μL為縱坐標，所測的相應(yīng)A595值的平均值為橫坐標，繪制標準曲線。標本蛋白濃度測定：取適量的待測蛋白溶液，加實驗用緩沖液至100 μL，再加入1 mL Bradford工作液，靜置3 min后測定A595值，重復(fù)3次，取其平均值。根據(jù)標準曲線，計算蛋白樣品的濃度。必要時需稀釋樣品，使其濃度在所測標準曲線的范圍內(nèi)。

1.2.2.2蛋白的酶解和iTRAQ標記將蛋白樣品加入胰蛋白酶消化過夜，將酶解樣品真空干燥后，溶于iTRAQ溶液緩沖液中。iTRAQ試劑114、115標記模型組，116、117標記安胃湯組，將標記后的所有肽段混合，標記后的樣品經(jīng)過C18 spin column除鹽柱除鹽，凍干。

1.2.2.3強陽離子柱色譜分離及反相液質(zhì)聯(lián)用分析干燥標記后的肽段用緩沖液A（10 mmol/L KH2PO4，25%ACN，pH 2.7）復(fù)溶，進到SCX強陽離子預(yù)裝柱（5 μm，2.1 mm×200 mm），以200 μL/min的速率進行梯度洗脫，緩沖液B（10 mmol/L KH2PO4，350 mmol/L KCl，25%ACN，pH 2.7）洗脫5 min，隨后將緩沖液B的比例由5%，對應(yīng)5 min，至25%對應(yīng)40 min按20個梯度上升，收集不同梯度濃度條件下洗脫的多肽。收集到的各組份樣品稀釋后進行反相C18柱（5 μm，77 μm×150 mm）用緩沖液B以5 min由5%到70 min上至35%梯度淋洗和點靶。

1.2.2.4質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜鑒定和相對定量分析采用5800 Plus MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，用Protein Pilot 2.0聯(lián)合Uniprot數(shù)據(jù)庫進行檢索鑒定蛋白，物種類別選擇大鼠，以滿足P＜0.05，Unused Score＞1.3且至少有1個肽段（peptides＞1）為鑒定標準報告 Confidence Interval＞95%的蛋白，以組間表達差異大于20%區(qū)分差異蛋白［3］，用114、115、116、117試劑報告離子的峰面積積分進行相對定量分析，以114、115為對照，按照116和117∶114和115的比值，即上調(diào)＞1.2，下調(diào)＜0.8，且P＜0.05的結(jié)果為差異蛋白。

1.2.3差異蛋白生物信息學(xué)分析蛋白的功能分析通過DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫進行搜索注釋和富集分析。提交90個差異蛋白作為進一步分析的蛋白集合，同時選擇相對應(yīng)的標識符為“UNIPROB ACCESION”，勾選大鼠全基因組作為背景基因，用“Convert Tool”對基因標識一體化，然后選擇“Functional Annotation Tool”作為分析工具，連接KEGG數(shù)據(jù)庫搜索進行信號傳導(dǎo)通路分析。

1.2.4蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析String是研究蛋白與蛋白相互作用的在線生物信息學(xué)網(wǎng)站，將本研究表達差異顯著蛋白信息導(dǎo)入，最低相互作用分值設(shè)置中度置信檔，利用Cytoscape構(gòu)建相互作用拓撲結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1胃竇組織形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠胃竇組織細胞排列正常，黏膜內(nèi)腺體分布均勻，形狀規(guī)整；模型對照組黏膜層腺體減少，炎性細胞大量浸潤，肉芽組織及纖維組織增生；安胃湯組黏膜腺體分布廣泛，形狀欠規(guī)整，炎性細胞散在浸潤。見圖1。

圖1 大鼠胃竇組織HE染色（×100）Fig.1 The rat gastric tissue stained by HE（×100）

2.2差異蛋白表達篩選結(jié)果安胃湯組與模型組比較，質(zhì)譜分析結(jié)果顯共鑒定出453個差異表達的蛋白。經(jīng)篩選共有90個蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表達上調(diào)的蛋白有60個，表達下調(diào)的蛋白有30個（表1）。

2.3差異蛋白GO富集分析結(jié)果經(jīng)分析共有40種生物學(xué)過程，10種細胞成分，9種分子功能GO分析顯著富集（P＜0.05），見圖2（生物學(xué)過程僅列出前10種）。

2.4差異蛋白富集信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析結(jié)果差異蛋白主要集中在80條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，其中經(jīng)Benjamini校正P＜0.05的有包括PI3K-AKT（圖3）、JAK-STAT、Alzheimer′s Disease等在內(nèi)的62條通路（圖4）。

表1 安胃湯對胃潰瘍肝郁脾虛大鼠胃竇組織作用的上下調(diào)蛋白Tab.1 Up-regulation and down-regulation of proteins in gastric ulcer rats with syndrome of liver constraint and spleen deficiency treated by Anwei decoction

圖2 差異蛋白的GO富集分析結(jié)果Fig.2 Results of GO enrichment analysis of differential proteins

2.5PPI分析結(jié)果差異表達蛋白相互作用拓撲網(wǎng)絡(luò)線路清晰，中心性較強，分散中心及孤立結(jié)點較少，作用相關(guān)性較強，其中AKT1、AKT2、PRKAA1、PIK3CG等蛋白為網(wǎng)絡(luò)圖的互作焦點（圖5）。

3 討論

安胃湯具有修復(fù)胃潰瘍組織，改善幽門螺桿菌感染，降低遠期復(fù)發(fā)率［4-5］，并減少萎縮性胃炎胃黏膜萎縮程度［6］的作用。本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同層次的“整體”的蛋白質(zhì)動態(tài)變化揭示和闡明疾病與證候的形成，藥物與機體相作用的生物學(xué)過程，是探討安胃湯干預(yù)肝郁脾虛證胃潰瘍機制的一個新切入點。

差異蛋白中富集分析發(fā)現(xiàn)：（1）蛋白質(zhì)磷酸化、氨基酸合成以及多種能量代謝相關(guān)的生物學(xué)過程方面較為突出，細胞成分較多集中在能量供應(yīng)的細胞器；（2）通路分析結(jié)果共得出PI3K-AKT、JAK-STAT、Alzheimer′s Disease等在內(nèi)的 62條通路，涉及不同系統(tǒng)，提示部分蛋白作用位可能恰好處于多條信號通路的重要交叉點或部分通路的亞級通路，有可能存在串?dāng)_機制；（3）PPI分析發(fā)現(xiàn)各節(jié)點聯(lián)系較強，分散中心及孤立結(jié)點較少。

圖3 PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖（標注五星的位置為本研究中差異蛋白）Fig.3 PI3K-AKT signaling pathway（the five-star marked indicates differential proteins in our study）

圖4 差異蛋白KEGG通路富集條形圖（條形圖表示本研究中差異蛋白在該通路中的數(shù)量）Fig.4 KEGG enrichment analysis bar chart of differential protein（bar chart represents the counts of our differential protein in each pathways）

胃潰瘍發(fā)生的病因復(fù)雜，在病理形成階段，組織黏膜細胞大量破壞，發(fā)生能量代謝障礙是其共同特點［7］。其中通過提供必需的氨基酸原料或降低代謝消耗，可以支持胃黏膜的修復(fù)并促進愈合［8-11］。富集分析表明多種能量代謝過程被進一步增強和激活，安胃湯有可能具備了類似機制。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Protein-protein interaction and topological structure diagram of differential proteins

值得注意的是PI3K-AKT信號通路，該通路能調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種機制，其中PI3K及AKT的激活可以抑制多種細胞凋亡，相反抑制其表達常用于促進腫瘤細胞凋亡［12-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)安胃湯可通過抑制PI3K-AKT表達從而對慢性萎縮性胃炎發(fā)揮療效［14］。本次結(jié)果中PRKAA1、PIK3CG、AKT2上調(diào)與治療萎縮性胃炎的調(diào)控方向相反，可能與預(yù)防胃潰瘍組織細胞凋亡、防治胃黏膜損傷有關(guān)。另外，SUN等［15］和SHEN等［16］的研究也發(fā)現(xiàn)腸三葉因子、康復(fù)新液等的胃黏膜保護作用與PI3K-AKT通路激活有關(guān)。

另外，該通路下游的Ras通路、VEGF通路、ErbB通路也顯著富集，EGF和VEGF表達量增加是促進黏膜血管再生修復(fù)并恢復(fù)胃潰瘍損傷組織功能的機制之一［17-18］。桃葉珊瑚甙、龍膽苦甙、石斛多糖等在修復(fù)不同證型的胃潰瘍中，與EGF、VEGF表達的變化也有明顯關(guān)聯(lián)［19-22］。前期研究已證實安胃湯能促進胃黏膜EGF的表達［5］，本次實驗中該通路的RAF1、SOS1等蛋白的差異表達，與前期研究有一定吻合。

PI3K-AKT下游mTOR通路也被富集，許多腫瘤細胞中存在有編碼mTOR信號通路內(nèi)相關(guān)蛋白的突變基因并且存在該通路蛋白的過度激活［23］，因此抑制該通路表達對治療癌變有一定價值［24］，中藥在治療功能性消化不良、癌前病變上通過調(diào)控該通路發(fā)揮療效［25-26］。安胃湯在治療慢性萎縮性胃炎上有一定療效［4］，該結(jié)果對后續(xù)進一步研究起到前瞻性作用。

綜上，本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析了安胃湯治療胃潰瘍的機制，可能與調(diào)節(jié)代謝、抑制細胞凋亡、促進黏膜再生等有關(guān)，其中PI3K-AKT通路及其下游信號通路與安胃湯前期研究機制存在部分切合，值得后續(xù)進一步探究。