一種源于枯草芽孢桿菌的新型甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因克隆與表達(dá)

王 笑，徐 錚，李 莎，徐 虹

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

稀少糖泛指自然界中難以尋覓、需通過(guò)人工合成才能獲取的糖類(lèi)；其中，稀少單糖占絕大多數(shù)，包括D-塔格糖、D-阿洛酮糖及D-阿洛糖等。各類(lèi)稀少單糖作為低熱量甜味劑、抗氧化劑、糖苷酶抑制劑以及核苷類(lèi)似物藥物，在食品、保健品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-3]。近年來(lái)，糖基異構(gòu)酶越來(lái)越多地應(yīng)用于稀少單糖的工業(yè)化生產(chǎn)[4-8]，其中，很多酶不僅可以催化糖磷酸化，也可以轉(zhuǎn)化單糖制備稀少糖，被應(yīng)用于多種稀少單糖的生產(chǎn)。例如，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(MPI)既能夠轉(zhuǎn)化甘露糖-6-磷酸為果糖-6-磷酸，又能夠催化L-核酮糖為L(zhǎng)-核糖[9-10]。L-核糖是一種新興的醫(yī)藥中間體，主要用于制備抗乙肝藥替比夫定(Sebivo)；隨著替比夫定的應(yīng)用規(guī)模擴(kuò)大和銷(xiāo)量進(jìn)一步提升，L-核糖的需求量日益擴(kuò)大。目前，僅能夠通過(guò)化學(xué)法制備L-核糖，此法產(chǎn)率較低、步驟繁瑣。因此，開(kāi)發(fā)一種生物制備L-核糖的技術(shù)十分必要。

在本研究中，筆者將一種來(lái)自枯草芽孢桿菌B.subtilisstr.168的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(BSMPI-2)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，考察其底物特異性以及對(duì)于L-核糖和L-核酮糖的異構(gòu)能力，以期為L(zhǎng)-核糖的生物制備提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、BL21(DE3)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisstr.168)、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，保存于南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建與基因表達(dá)

依據(jù)GenBank上報(bào)道的B.subtilis的BSMPI-2編碼核酸序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。上游引物：5′-CCGGAATTCATGTCAACAGTAAGTACAAAAC-3′(劃線部分為EcoRⅠ位點(diǎn))，下游引物：5′-C-C-G-C-T-C-G-A-G-T-T-A-T-T-T-A-A-T-T-A-T-T-A-C-G-T-A-T-T-C-C-A-3′(劃線部分為XhoⅠ 位點(diǎn))?？莶菅挎邨U菌B.subtilisstr.168在32 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜，利用Axygen的基因組提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA作為PCR擴(kuò)增BSMPI-2基因的模板。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min結(jié)束；將PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

對(duì)pET-28a(+)用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切、將擴(kuò)增后的BSMPI-2基因與線性化的質(zhì)粒同源重組后獲得BSMPI-2基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BSMPI-2。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在卡那霉素(Kan)抗性平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)菌液PCR鑒定pET-28a(+)-BSMPI-2是否正確轉(zhuǎn)化。驗(yàn)證正確后，從大腸桿菌DH5α中提取正確連接的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BSMPI-2。將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BSMPI-2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)，挑取轉(zhuǎn)化子于10 mL的LB培養(yǎng)基中(含25 μg/mL卡那霉素)，培養(yǎng)12 h，以2%接種量轉(zhuǎn)接于400 mL的LB培養(yǎng)基(含25 μg/mL卡那霉素)的帶擋板1 000 mL錐形瓶?jī)?nèi)，在37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，取1 mL菌液進(jìn)行破碎和離心處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.3 重組蛋白純化

用含10%(體積分?jǐn)?shù))甘油的pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液重新懸浮誘導(dǎo)表達(dá)后的重組工程菌。對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行裂解，在低溫條件下以12 000g離心裂解液30 min。將得到的粗酶液上清載入Ni-NTA親和層析樹(shù)脂，樹(shù)脂載樣前用10%甘油、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和500 mmol/L NaCl平衡，緊接著用10%甘油、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、500 mmol/L NaCl和50 mmol/L咪唑洗去雜蛋白，至OD280趨于穩(wěn)定，用10% 甘油、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、500 mmol/L NaCl和500 mmol/L 咪唑洗脫目的蛋白，最后所得的純酶液經(jīng)HiPrep 26/10 除鹽柱(GE Healthcare Corp.)處理除去咪唑鹽，最終得到異源表達(dá)的重組蛋白BSMPI-2。

1.4 重組蛋白活力測(cè)定

MPI對(duì)于L-核酮糖的催化最終趨于反應(yīng)平衡，且該異構(gòu)反應(yīng)是可逆的。鑒于L-核酮糖純品價(jià)格昂貴且不易獲得，故以MPI對(duì)L-核糖的催化活力為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定重組蛋白的酶活力。

測(cè)定原理：酮糖在H2SO4的催化下能與咔唑進(jìn)行反應(yīng)，兩者之間縮合生成化合物顏色介于紫色和紅色之間，顯色程度與酮糖的含量成線性關(guān)系。所以可以利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在530 nm處的吸光值,計(jì)算得到BSMPI-2的活力。

咔唑顯色法反應(yīng)體系：在5 mL離心管中，先后加入500 μL 糖液、100 μL 15 g/L半胱氨酸溶液、3 mL 70%H2SO4以及100 μL 0.12%咔唑酒精溶液，并迅速混合均勻，60 ℃水浴反應(yīng)10 min，于530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSMPI-2基因的克隆及序列分析

用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知：擴(kuò)增得到大小為950 bp的DNA片段，與預(yù)期大小相符?；厥掌危寺∷椭凉緶y(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上發(fā)表的序列比對(duì)，同源性為100%，因此，本研究克隆的BSMPI-2基因的氨基酸序列與GenBank公布的序列(登錄號(hào)：AF324506)完全相同。然而，前人從未對(duì)此甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶進(jìn)行研究，僅報(bào)道了一級(jí)序列。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BSMPI-2的PCR電泳圖Fig.1 PCR analysis of BSMPI-2 gene from recombinant plasmid

圖2 重組蛋白BSMPI-2的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein of BSMPI-2

2.2 BSMPI-2在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

含pET-28a(+)-BSMPI-2的BL21(DE3)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，破碎細(xì)胞，分離純化酶蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知：分離純化得到大小約為3.54×104的BSMPI-2重組蛋白表達(dá)條帶，且條帶很清晰，大小與預(yù)期結(jié)果相符，表明實(shí)現(xiàn)了BSMPI-2基因在大腸桿菌中的正確表達(dá)。

2.3 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

在不同溫度下，利用純化所得的BSMPI-2催化L-核糖進(jìn)行反應(yīng)，判斷溫度對(duì)BSMPI-2催化活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知：BSMPI-2的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，定義此時(shí)的酶活為100%。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，BSMPI-2的相對(duì)酶活為(21±0.5)%，在溫度達(dá)到60 ℃之前，BSMPI-2的酶活隨著溫度的升高而增加。當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，酶活喪失得十分迅速。因此，BSMPI-2的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖3 溫度對(duì)BSMPI-2酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on BSMPI-2 activity

2.4 最適pH的測(cè)定

以純酶BSMPI-2為研究對(duì)象，在pH 4～11的范圍內(nèi)研究pH對(duì)BSMPI-2酶活的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)BSMPI-2酶活的影響Fig.4 Effect of pH on BSMPI-2 activity

由圖4可知：BSMPI-2酶促反應(yīng)最適pH為8.0左右，此時(shí)酶活最高。pH為4.0～6.0時(shí)，BSMPI-2酶活相對(duì)低下，說(shuō)明BSMPI-2不適合在酸性條件下進(jìn)行催化反應(yīng)。隨著pH的增加，酶活逐漸提高。當(dāng)pH超過(guò)8.0，酶活逐漸降低，pH為9.0時(shí)，BSMPI-2依然保持著64%的相對(duì)酶活，該酶在堿性條件下仍可保持催化活力。

2.5 金屬離子及EDTA對(duì)BSMPI-2酶活的影響

考察在終濃度1 mmol/L條件下金屬離子對(duì)BSMPI-2酶活力的影響，結(jié)果如表1所示。

由從表1可以看出：不同二價(jià)金屬離子對(duì)BSMPI-2酶活的影響差異較大，其中Cu2+、Ca2+、Ba2+和Mg2+對(duì)酶有一定的抑制作用，Co2+、Mn2+和Ni2+可以提高BSMPI-2的活力，Co2+對(duì)酶活的促進(jìn)最大，相對(duì)酶活提升到對(duì)照組的225%。

表1 金屬離子及EDTA對(duì)BSMPI-2的影響

在已知Co2+能夠提高BSMPI-2催化活力的情況下，為了在生產(chǎn)中利用這一特點(diǎn)來(lái)提高L-核糖的產(chǎn)率，進(jìn)一步測(cè)定不同濃度Co2+對(duì)BSMPI-2的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：當(dāng)Co2+濃度為0.5 mmol/L時(shí)，BSMPI-2的催化活力得到最大的提高，而隨著Co2+濃度的升高，BSMPI-2的催化活力反而呈下降趨勢(shì)。因此，在利用BSMPI-2生產(chǎn)核糖的過(guò)程中，加入0.5 mmol/L的Co2+可以使BSMPI-2的催化活力提高到(251±2)%。

圖5 BSMPI-2的最適Co2+濃度Fig.5 Optimum concentration of cobalt ion for BSMPI-2

2.6 BSMPI-2的熱穩(wěn)定性

在不同溫度下，對(duì)BSMPI-2進(jìn)行不同時(shí)間的熱處理，使用熱處理之后的酶液反應(yīng)，考察BSMPI-2的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 BSMPI-2的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of BSMPI-2

由圖6可知：在溫度高于60 ℃時(shí)，酶活迅速喪失，而在最適反應(yīng)溫度60 ℃以下時(shí)，酶活力半衰期為2 h。

2.7 BSMPI-2的底物特異性

BSMPI-2在催化功能上屬于典型的醛-酮糖異構(gòu)酶，考察BSMPI-2對(duì)各類(lèi)醛酮糖的異構(gòu)作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知：作為已報(bào)道的天然底物，BSMPI-2對(duì)L-核糖具有最強(qiáng)的催化能力，相對(duì)其他醛糖，包括D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖和L-阿拉伯糖，作為底物時(shí)的酶活力則非常低，說(shuō)明這類(lèi)醛糖都不能被BSMPI-2催化，BSMPI-2的底物譜并不寬泛。

表2 BSMPI-2底物特異性

2.8 BSMPI-2對(duì)L-核糖的催化

BSMPI-2以醛糖為底物時(shí)，對(duì)L-核糖表現(xiàn)出最高的比酶活。因此，在10 mmol/L的底物濃度下，使用BSMPI-2對(duì)L-核糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知：轉(zhuǎn)化3 h后，L-核糖以29%的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-核酮糖，最終趨于71∶ 29的反應(yīng)平衡，意味著這是一種可逆的異構(gòu)反應(yīng)。所以文獻(xiàn)報(bào)道L-核糖具有高酶活的MPI，也可以催化L-核酮糖生成L-核糖[11-13]，而與已報(bào)道的催化L-核酮糖生產(chǎn)L-核糖的MPI相比，良好的熱穩(wěn)定性及更高的最適反應(yīng)溫度，使得BSMPI-2可以在更高的溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)，具有更高的催化效率。

圖7 BSMPI-2對(duì)L-核糖的生物催化Fig.7 Biocatalysis of L-ribose by BSMPI-2

3 結(jié)論

通過(guò)挖掘一種來(lái)自B.subtilisstr.168的新型甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶——BSMPI-2，開(kāi)展了基因克隆、外源表達(dá)、酶純化和酶學(xué)性質(zhì)表征工作，獲得如下結(jié)論。

1)B.subtilisstr.168來(lái)源的BSMPI-2的最適催化溫度和最適催化pH分別為60 ℃和8.0，在高溫下有著較長(zhǎng)的半衰期，添加0.5 mmol/L的Co2+，對(duì)BSMPI-2的活力有著顯著促進(jìn)作用。

2) BSMPI-2的底物專(zhuān)一性較強(qiáng)，僅能催化L-核糖，對(duì)其他醛糖如D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖和L-阿拉伯糖均無(wú)催化活力，在pH 8.0、60 ℃、添加0.5 mmol/L Co2+條件下，以L-核糖為底物，催化2 h后，將29%的L-核糖異構(gòu)為L(zhǎng)-核酮糖。

3)利用BSMPI-2對(duì)L-核糖和L-核酮糖的催化反應(yīng)平衡，可以實(shí)現(xiàn)一條生物催化制備L-核糖的新型路線，與其他應(yīng)用于L-核糖生物催化的MPI相比，本研究中的MPI有著較好的催化溫度和熱穩(wěn)定性，為高效的生物催化產(chǎn)L-核糖提供了新思路。