響應(yīng)面法優(yōu)化龍牙百合多糖的高溫高壓水提取法工藝

藍海軍，何美娟，羅晨曦，畢雙同

(1.江西贛糧實業(yè)有限公司 院士工作站，江西 南昌 330200；2.江西省兒童醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江西 南昌 330006)

龍牙百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)是我國經(jīng)濟型食用百合中的優(yōu)良品種，因其個大、鱗片狹長且肥厚、狀若龍爪、色白若象牙，故名為“龍牙百合”[1]，以江西萬載、永豐和湖南隆回3地所產(chǎn)尤為知名[2]。龍牙百合主要可食用部分為地下鱗莖，其營養(yǎng)價值和藥用價值都很高，特別在呼吸道疾病的防治方面有積極效果，是我國首批藥食兩用植物之一。目前百合除被大量用作日常食用外，還可加工成百合粉、百合飲料、百合干、百合餅干和百合罐頭等[3]。

百合中含有豐富的多糖、多酚、黃酮和皂苷等活性成分[4-7]，其中百合多糖是百合的主要活性功能成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有消炎、抗疲勞、抗抑郁、降血糖和抗氧化等作用[5-9]。劉成梅等[10]發(fā)現(xiàn)百合多糖對四氧嘧啶引起的高血糖小白鼠有明顯的降血糖功能；李化強等[5]發(fā)現(xiàn)龍牙百合粗多糖的清除能力強于精制多糖，但均弱于維生素C。

百合多糖的提取方式?jīng)Q定了其純度、結(jié)構(gòu)和活性，目前國內(nèi)外主要的提取方式有熱水浸提、微波輔助提取、超聲波輔助提取、酶法和酸堿法等。例如熊明郁等[11]用水提法提取百合多糖；張占軍等[12]用超聲輔助提取百合多糖；Zhao等[13]采用微波輔助提取百合多糖；高清雅等[14]用超聲波和酶協(xié)同作用提取百合多糖。這些方法各有優(yōu)缺點。熱水提取法成本低、操作簡單，但存在時間長、提取效率低的缺點。微波和超聲波法時間短、溶劑消耗量小、效率高，但須要專門設(shè)備，產(chǎn)業(yè)化成本和難度較高。酶法綠色、快速，但是酶制劑成本較高。高溫水提法具有快速、高效等優(yōu)點，但目前對其提取百合多糖的研究還較少。

因此，本研究以江西宜春市萬載縣龍牙百合為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化高壓高溫水提法提取百合多糖的工藝，以期為龍牙百合的開發(fā)利用提供一定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍牙百合，購自江西萬載地區(qū)；濃H2SO4、苯酚和葡萄糖等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外分光光度計，日本島津儀器公司；BT224S型電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；TD型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；RE52-A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SN510C型立式壓力蒸氣滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多糖的提取方法

龍牙百合清洗干凈后，將其切成大小均勻的條狀。稱取10.0 g百合于250 mL錐形瓶中，按適當?shù)牧弦罕燃尤胝麴s水，攪拌均勻，置于高壓滅菌鍋中，在一定條件下進行提取，冷卻后，4 000 r/min離心15 min，抽濾取得濾液，將濾渣進行重復(fù)提取，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮定容至50 mL，得龍牙百合粗多糖溶液。

1.3.2 多糖提取得率的測定

參考熊明郁等[11]和張雪春等[15]的方法并稍作修改，精確移取1.0 mL粗多糖溶液，用蒸餾水稀釋至100 mL。從稀釋液中移取1.0 mL溶液加入干燥的帶塞試管內(nèi)，加入4.0 mL硫酸-苯酚溶液，輕微振蕩均勻，置于沸水浴中反應(yīng)30 min后迅速取出，用水冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光值。同時以不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液(0～100 μg/mL)代替樣品與硫酸-苯酚溶液反應(yīng)，繪制葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值的標準曲線，并按式(1)計算多糖得率。

(1)

式中：V為提取液體積，mL；ρ為提取液中多糖質(zhì)量濃度，g/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

1) 料液比對多糖得率的影響

固定提取溫度120 ℃，時間1 h，次數(shù)2次，選取料液比(g/mL)分別為1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25和1∶ 30進行多糖提取，考察料液比對百合多糖得率的影響。

2) 提取溫度對多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，時間1 h，次數(shù)2次，選取溫度分別為100、110、120、130和135 ℃進行多糖提取，考察提取溫度對百合多糖得率的影響。

3) 提取時間對多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，溫度120 ℃，次數(shù)2次，選取時間分別為30、60、90、120和150 min進行多糖提取，考察提取時間對百合多糖得率的影響。

4) 提取次數(shù)對多糖得率的影響

固定料液比(g/mL)為1∶ 20，溫度120 ℃，時間1 h、選取提取次數(shù)分別為1、2、3、4和5次進行多糖提取，考察提取次數(shù)對百合多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對百合多糖得率影響較大的因素，采用Design Expert 8.05b軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，以百合多糖提取得率為響應(yīng)值，優(yōu)化后得最佳提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

根據(jù)葡萄糖質(zhì)量濃度與測定的吸光度值繪制的標準曲線見圖1。由圖1可知：蒽酮顯色后的吸光度值與葡萄糖質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.123 4+0.003 75X，R2=0.996，說明方程能較好地表示樣品的葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度之間的關(guān)系，可用于樣品的測定。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對多糖得率的影響分析

料液比對百合多糖得率影響的曲線見圖2。由圖2可知：百合多糖得率隨料液比增大而增大，在料液比(g/mL)為1∶ 20時，多糖得率為(6.21±0.04)%，此后繼續(xù)增大料液比，多糖得率增大趨勢不明顯。可能是因為料液比(g/mL)在1∶ 20的條件下，百合組織中的多糖浸出已經(jīng)較為充分[16]。此后再增大料液比，雖然多糖得率有所提高，但是提高程度較低，從實驗時間、操作方便性和成本考慮，選取料液比(g/mL)1∶ 20為最佳試驗條件。

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.2 提取溫度對多糖得率的影響分析

提取溫度對百合多糖得率影響的曲線見圖3。由圖3可知：百合多糖得率隨溫度增大而呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，在提取溫度為120 ℃時，多糖得率最高為(6.20±0.09)%。原因是升高提取溫度，對百合細胞破壞程度較大，有助于多糖在體系中的溶出。但溫度過高，降低了百合表面的張力，增加了表面微氣泡的蒸氣壓，反而降低了多糖的溶出效果[12]，因此，選取提取溫度120 ℃為最佳試驗條件。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3 提取時間對多糖得率的影響分析

提取時間對百合多糖得率影響的曲線見圖4。由圖4可知：隨提取時間的延長，百合多糖得率不斷上升，在90 min時多糖得率最大，達到(6.25±0.03)%，繼續(xù)延長提取時間，多糖得率反而緩慢下降。原因是提取一定時間后，百合細胞膜內(nèi)外的滲透濃度逐漸相等，多糖不再溶出，另外高溫提取時間過長，對多糖結(jié)構(gòu)可能有一定的破壞[17]。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide

圖5 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the yield of polysaccharide

2.2.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響分析

提取次數(shù)對百合多糖得率影響的曲線見圖5。由圖5可知：百合多糖得率隨提取次數(shù)的增加而上升，提取2次時基本已被提取出來，此后繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖得率呈緩慢上升趨勢。因此，從工作量和成本考慮，選取2次為單因素試驗最佳提取次數(shù)。

2.3 響應(yīng)面試驗

根據(jù)2.2節(jié)單因素試驗的結(jié)果，固定提取次數(shù)為2次，選取料液比、提取溫度和提取時間為試驗因素，以百合多糖得率為試驗響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面進行優(yōu)化試驗，因素水平表和響應(yīng)面分析試驗根據(jù)文獻[15]設(shè)計，其結(jié)果見表1和2。

表1 響應(yīng)面因素及水平表

通過Design Expert 8.05b軟件對表2中的試驗結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，得到該試驗的回歸模型方程Y′=6.374+0.221 25A+0.072 5B+0.081 25C+0.022 5AB-0.04AC-0.007 5BC-0.034 7A2-0.329 5B2-0.267 8C2。模型系數(shù)顯著性結(jié)果和方差分析結(jié)果見表3和4。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計和結(jié)果

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗

表4 方差分析表

由表3可知：該模型的P值極顯著(P<0.000 1)，R2=0.975 6，表示方程能較好地反映各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，并預(yù)測最佳合成條件。失擬項P值為不顯著，說明方程擬合度較好。各因素對試驗影響程度由大到小依次為料液比(極顯著)、時間(顯著)、溫度(顯著)。

各因素之間交互作用對百合多糖得率的影響結(jié)果見圖6。比較圖6(a)、6(b)和6(c)之間可知：料液比與時間交互作用的曲線橢圓程度大于料液比與溫度的交互作用，且大于溫度與時間的交互作用。該結(jié)果與表3中影響因素A、C大于影響因素A、B，大于影響因素B、C，所得P值的結(jié)果也是一致的。

圖6 各因素相互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of the effects of the operating parameters on the yield of polysaccharide

2.4 方程的求導(dǎo)和驗證

通過響應(yīng)面優(yōu)化得到百合多糖最高得率為6.258%，利用Design Expert 8.05b軟件對方程進行求導(dǎo)，得到最佳條件為料液比(g/mL)1∶ 24.98，溫度121.44 ℃，時間92.25 min。為方便操作，取料液比(g/mL)為1∶ 25、溫度121 ℃、時間92 min，對方程進行驗證，在此條件下百合多糖得率為6.284%，接近預(yù)測值，證明該方程可行。

3 結(jié)論

采用高溫水溶液提取百合中的多糖，經(jīng)單因素試驗表明，百合多糖提取的最佳條件分別為料液比(g/mL)1∶ 20，溫度120 ℃，時間90 min，次數(shù)2次。在此基礎(chǔ)上固定提取次數(shù)2次，選取料液比、溫度和時間為變量，以多糖得率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到最佳提取條件為料液比(g/mL)1∶ 25，溫度121 ℃，時間92 min。該條件下百合多糖得率為6.284%，明顯高于文獻報道所采用熱水浸提法的0.92%。該方法簡單、易操作，比較適用于百合多糖的提取。