3-甾酮-9α-羥基化酶基因的表達(dá)及其催化合成9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮

王 康，吳志革，趙偉睿,3，胡 升，麻菊美，王進(jìn)波，姚善涇，梅樂(lè)和

(1.浙江大學(xué) 寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 寧波 315100；2.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027；3.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058)

9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是甾體類藥物合成的重要前體物質(zhì)，常用于抗雌性激素、抗雄性激素和避孕功能藥物以及皮質(zhì)藥物的合成[1-2]。目前，由于甾體的9α-羥基化很難用化學(xué)法進(jìn)行，一般使用微生物轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)[3-5]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已從微生物中鑒定了甾體9α-羥基化的關(guān)鍵酶即3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH)[6-9]。KSH屬于IA家族末端單加氧酶，由末端加氧酶(KshA)和鐵氧還原酶(KshB)組成。其中，KshA是主反應(yīng)進(jìn)行的活性中心，其與甾體物質(zhì)的特異性結(jié)合是KSH進(jìn)行9α-羥基化反應(yīng)的關(guān)鍵。對(duì)于不同的甾體底物，選擇合適的KshA酶至關(guān)重要[10-11]。雖然目前關(guān)于KSH的研究多集中于分枝桿菌和紅球菌屬[6,8-9]，但甾體物質(zhì)關(guān)鍵代謝途徑的發(fā)現(xiàn)為利用大腸桿菌等工程菌構(gòu)建高催化9α-羥基化能力的工程菌株提供了可能，有利于縮短9α-OH-AD的生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本。但由于受合適的kshA基因篩選難度大且穩(wěn)定性較差、涉及NADH輔酶系統(tǒng)等因素影響，目前仍處于初步嘗試階段，產(chǎn)率較低。最早在2006年，來(lái)源于Mycobacteriumsmegmatismc2155的kshA基因被證實(shí)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中具有催化活性，但是產(chǎn)物濃度較低，僅能在色譜中檢測(cè)到[2]；2007年，在大腸桿菌BL21中表達(dá)的分枝桿菌Mycobacteriumsmegmatis的甾體9α-羥基化基因，在以黃體酮(PS)為底物時(shí)，經(jīng)過(guò)7 d的反應(yīng)，有43.6 mg/L的9α-羥基化產(chǎn)物生成[7]；2009年，來(lái)源于RhodococcusrhodochrousDSM 43269中的kshA基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了研究，但單獨(dú)表達(dá)kshA的菌株并沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性[12]；2010年，在大腸桿菌中表達(dá)的分支桿菌MycobaterriumneoaurumMwIB-01的kshA基因，在底物投料濃度為1.5 μmol/L時(shí)，反應(yīng)體系經(jīng)萃取濃縮后，經(jīng)液質(zhì)連用檢測(cè)到9α-OH-AD的產(chǎn)生[13]。截至目前，在大腸桿菌中單獨(dú)表達(dá)kshA研究的催化效率仍然較低，這限制了大腸桿菌系統(tǒng)在制備9α-OH-AD中的應(yīng)用。

本文中，筆者對(duì)2種可進(jìn)行甾醇9α位羥基化的RhodococcuserythropolisSQ1的rekshA和M-y-c-o-b-a-c-t-e-r-i-u-mtuberculosisH37Rv的mtkshA基因表達(dá)進(jìn)行比較研究，通過(guò)基因序列優(yōu)化以提升蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)水平，并基于RekshA的工程表達(dá)菌株，以雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)為底物，對(duì)制備9α-OH-AD的催化反應(yīng)進(jìn)行初步探索，以期開發(fā)新型9α-OH-AD生物轉(zhuǎn)化工藝，為9α-OH-AD的高效、低成本生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AD、9α-OH-AD(純度大于98%)，寧波旋光醫(yī)藥有限公司；其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

pET-28a(+)質(zhì)粒保存于浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、核酸內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ，TaKaRa公司；E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶及DNA聚合酶，Transgen公司。

基因序列的測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 KshA基因的序列優(yōu)化及序列合成

應(yīng)用Jcat軟件[14](http://www.jcat.de)對(duì)rekshA與mtkshA基因序列進(jìn)行優(yōu)化，得到rekshA-yh與mtkshA-yh基因序列。將獲得的rekshA、mtkshA、rekshA-yh和mtkshA-yh基因序列送至上海捷瑞公司合成，并在基因的5′端和3′端分別加入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.3 工程菌株的構(gòu)建

用NheI、XhoI對(duì)上述kshA基因和pET28a(+)分別進(jìn)行雙酶切，T4DNA連接酶連接，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到工程菌株BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh與BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh。

1.4 KshA基因的表達(dá)及蛋白檢測(cè)

挑取BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh與BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh單菌落進(jìn)行活化；然后以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，待菌液生長(zhǎng)到OD600為0.5～1.0時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于28 ℃、150 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心收集菌體，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸菌體，超聲破胞，離心取上清液，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.5 重組菌株轉(zhuǎn)化AD制備9α-OH-AD的活性檢測(cè)

將重組菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh與BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh活化后，以2%的接種量接種于TB培養(yǎng)基中。在37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，同時(shí)加入溶解于二甲基亞砜(DMSO)的底物AD至終濃度為300 μmol/L。于搖床中30 ℃振蕩反應(yīng)，24 h后取樣，使用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.6 產(chǎn)物9α-OH-AD的HPLC檢測(cè)

取適量的反應(yīng)液樣品，12 000 r/min離心2 min去除菌體，取上清液，使用水相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析成分。HPLC檢測(cè)條件為：液相柱采用Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=5∶ 5，流速為1 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣體積20 μL。

1.7 不同因素對(duì)重組菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh制備9α-OH-AD催化反應(yīng)的影響

1)培養(yǎng)基對(duì)反應(yīng)的影響分析 將菌種分別接種到LB和TB培養(yǎng)基中，OD600為0.5～1.0時(shí)，同時(shí)加入0.5 mmmol/L的IPTG和300 μmol/L AD(溶解于DMSO)，于30 ℃搖床中反應(yīng)，在12、24、36、48、60和72 h分別取樣，測(cè)量菌體生物量和反應(yīng)得率。

2)IPTG濃度對(duì)反應(yīng)的影響分析 菌液培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0時(shí)，分別加入0、0.01、0.05、0.10、0.25、0.50和1.00 mmol/L的IPTG和200 μmol/L AD(溶解于DMSO)，于30 ℃搖床中反應(yīng)，24 h后取樣進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算得率。

3)助溶劑選擇對(duì)反應(yīng)的影響分析 菌液培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0時(shí)，加入0.1 mmol/L的IPTG和200 μmol/L AD，并使反應(yīng)液中分別含有0.8%乙醇、甲醇、丙酮和DMSO作為助溶劑，于30 ℃搖床中反應(yīng)，24 h后取樣進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算得率。

4)底物添加時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響分析 菌液培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0時(shí)，加入0.1 mmol/L的IPTG，并分別在加入IPTG后的0、6、12、18和24 h，加入500 μmol/L溶解于乙醇中的底物AD，于30 ℃搖床中反應(yīng)，在反應(yīng)的12、24、36、48、60和72 h分別取樣，測(cè)量菌體生物量和反應(yīng)得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 rekshA及mtkshA基因序列的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)優(yōu)化的基因序列往往能提高mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于新生肽段的正確折疊，提高外源活性蛋白的表達(dá)。通過(guò)與大腸桿菌E.coliK12菌系的密碼子偏好性及最適GC百分比進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因rekshA和mtkshA序列中的GC百分比分別為62.33%和60.7%，遠(yuǎn)高于大腸桿菌的最適GC百分比(如EscherichiacoliK12中為52.35%)，同時(shí)含有GUC(Val)和CCC(Pro)等低頻密碼子。通過(guò)同義轉(zhuǎn)換，rekshA-yh基因共替換了224個(gè)堿基，GC百分比降為52.33%，與原序列的相似度為81.24%，mtkshA-yh共替換了221個(gè)堿基，GC百分比降為51.55%，與原序列相似度為80.92%。

2.2 KshA的蛋白表達(dá)

對(duì)上述重組工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知：與陰性對(duì)照相比，BL21(DE3)-pET28a-mtkshA、BL21(DE3)-pET28a-rekshA、BL21(DE3)-pET28a-mtkshA-yh與BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh的粗酶液樣品在4.0×104與5.0×104條帶中間均多出1條明顯的條帶，與MtkshA和RekshA的理論大小4.427×104、4.45×104相符合。

對(duì)比圖1(a)與圖1(b)可見，優(yōu)化后的rekshA-yh較rekshA的可溶性表達(dá)有非常明顯的提高；對(duì)比圖1(c)與圖1(d)可見，優(yōu)化后的mtkshA-yh比mtkshA的可溶性表達(dá)也有一定的提升，達(dá)到了通過(guò)基因序列的優(yōu)化提高外源活性蛋白表達(dá)的預(yù)期目的，進(jìn)一步證明了基因序列的優(yōu)化是提高蛋白可溶性表達(dá)的重要途徑之一。

2.3 重組菌株轉(zhuǎn)化AD制備9α-OH-AD的活性

樣品經(jīng)離心、微濾處理后，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析及與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)以確認(rèn)9α-OH-AD產(chǎn)物峰和AD底物峰的位置，結(jié)果見圖2。

通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線換算及圖2結(jié)果可知：MtKshA表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化AD產(chǎn)生9α-OH-AD的得率較低，在TB培養(yǎng)基中經(jīng)24 h的反應(yīng)，9α-OH-AD的得率僅為2.7%，而ReKshA表達(dá)菌株卻可以較好地轉(zhuǎn)化AD產(chǎn)生9α-OH-AD，得率為63.86%，是MtKshA的23.57倍。以上結(jié)果表明，ReKshA是催化AD合成9α-OH-AD較為理想的催化劑。

2.4 重組菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh轉(zhuǎn)化AD制備9α-OH-AD

以AD為底物，研究不同培養(yǎng)基對(duì)9α-OH-AD轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重組菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh在LB培養(yǎng)基中菌體生物量處于較低水平，OD600為2.075時(shí)，9α-OH-AD的得率僅為2.85%。而在TB培養(yǎng)基中，工程菌菌體濃度處于較高水平，OD600為11.25時(shí)，9α-OH-AD的得率達(dá)85.7%。由此說(shuō)明，高生物量對(duì)于9α-OH-AD的制備較為關(guān)鍵。

考察IPTG濃度對(duì)得率的影響，結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知：當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，200 μmol/L底物經(jīng)過(guò)24 h反應(yīng)，9α-OH-AD得率最高，達(dá)72.54%。

因?yàn)榈孜顰D的水溶性較差，筆者選取了甲醇、乙醇、丙酮和DMSO 4種不同的助溶劑進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知：乙醇的助溶效果最好，200 μmol/L底物經(jīng)過(guò)24 h反應(yīng)，9α-OH-AD得率為90.62%，比DMSO的提高了14.85%。

在催化反應(yīng)過(guò)程中，底物可能會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)及蛋白表達(dá)產(chǎn)生不利影響。筆者進(jìn)一步考察在添加IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)后，不同底物添加時(shí)間對(duì)菌體濃度和反應(yīng)得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：底物的添加時(shí)間對(duì)菌體的生物量影響較小，說(shuō)明AD并不抑制菌體的生長(zhǎng)(圖4(a))；但底物的添加時(shí)間對(duì)底物轉(zhuǎn)化率有著顯著影響，表現(xiàn)為隨著底物添加時(shí)間的推遲，9α-OH-AD得率逐步降低(圖4(b))。推測(cè)其原因可能與反應(yīng)的時(shí)間有關(guān)，越早加入的實(shí)驗(yàn)組相較于較晚加入的反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)，所以得率更高。

圖2 AD、9α-OH-AD的液質(zhì)分析圖譜Fig.2 LC-MS analysis of AD，9α-OH-AD and HPLC analysis of the relationship between peak area and the concentration of 9α-OH-AD

圖3 IPTG濃度和助溶劑對(duì)反應(yīng)得率的影響Fig.3 Effects of IPTG concentration and cosolvent on reaction yield

圖4 底物添加時(shí)間對(duì)菌體生物量和反應(yīng)得率的影響Fig.4 Effects of time-points of substrate addition on cell growth and productive yield

在上述研究基礎(chǔ)上，筆者在反應(yīng)體系中加入500 μmol/L底物，以0.8%(體積分?jǐn)?shù))乙醇為助溶劑，在150 r/min攪拌條件下，底物與IPTG同時(shí)加入，30 ℃反應(yīng)48 h，9α-OH-AD得率達(dá)到了97.09%。

3 結(jié)論

基于大腸桿菌開發(fā)高效、低成本的雄甾-4-烯-3,17-二酮9α位羥基生物合成方法，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。筆者對(duì)來(lái)自分枝桿菌M-y-c-o-b-a-c-t-e-r-i-u-mtuberculosisH37Rv 與紅平紅球菌RhodococcuserythropolisSQ1的kshA基因進(jìn)行了序列優(yōu)化，提高了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，在以AD為底物，對(duì)來(lái)源于紅平紅球菌RhodococcuserythropolisSQ1的kshA基因進(jìn)行優(yōu)化后構(gòu)建的工程菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh表現(xiàn)出更好的9α-羥基化活性。進(jìn)一步對(duì)基于工程菌BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh制備9α-OH-AD的生物催化工藝進(jìn)行了初步探索，在底物濃度為500 μmol/L的條件下，經(jīng)48 h的反應(yīng)，產(chǎn)物9α-OH-AD的得率可達(dá)97.09%，反應(yīng)效率較以往的體系得到了極大的提升，實(shí)現(xiàn)了9α-OH-AD的高效轉(zhuǎn)化，為將來(lái)9α-OH-AD的高效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

與此同時(shí)，本研究進(jìn)一步證明了kshA在大腸桿菌中可獨(dú)立于kshB發(fā)揮作用，為后續(xù)基于單獨(dú)kshA的高效催化劑開發(fā)提供了新的思路。