兔自體BMSC移植修復(fù)前交叉韌帶損傷效果及對血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平的影響

史開宇，趙其純

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥230032;2 安徽省立醫(yī)院)

前交叉韌帶損傷是臨床較常見的運(yùn)動損傷，但因疼痛不明顯易導(dǎo)致誤診，使患者錯(cuò)過最佳的治療時(shí)期而延誤治療[1]。前交叉韌帶損傷因缺少血液供應(yīng)，損傷后多不能自行愈合，可通過手術(shù)重建治療。但是，術(shù)后愈合速度受多種因素的干擾，包括神經(jīng)營養(yǎng)、重建肌腱的血液供應(yīng)、炎性物質(zhì)的產(chǎn)生等[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一種多功能干細(xì)胞，可以自我完成更新和分化。尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)可水解纖維蛋白溶酶原，可促進(jìn)基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)；轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)對細(xì)胞有絲分裂有重要作用，可加強(qiáng)損傷處愈合；白細(xì)胞介素1(IL-1)可增加代謝因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能；IL-4加速B細(xì)胞分裂，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能，還可誘導(dǎo)未分化細(xì)胞向髓樣細(xì)胞分化。因此，血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平可以間接反映修復(fù)效果。2018年3～6月，我們建立了前交叉韌帶損傷兔模型，觀察自體BMSC移植修復(fù)前交叉韌帶損傷的效果及對這些因子的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康成年雄性新西蘭大白兔60只(天津市百農(nóng)實(shí)驗(yàn)動物繁育科技有限公司)，兔齡為11～12個(gè)月，體質(zhì)量3.2～3.8 kg。主要試劑、儀器：兔抗大鼠u-PA抗體(天根生化科技有限公司)，小鼠抗大鼠TGF-β抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，大鼠抗小鼠IL-1、IL-4抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，ELISA試劑盒(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；WDW-100微機(jī)控制電子萬能生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(濟(jì)南時(shí)代山峰儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)與分組 動物飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，室內(nèi)濕度35%～40%；飼養(yǎng)室定時(shí)進(jìn)行紫外線照射消毒，分籠飼養(yǎng)；統(tǒng)一喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由活動；逐個(gè)檢查兔的四肢健康情況，確保膝關(guān)節(jié)無腫脹畸形，雙膝關(guān)節(jié)抽屜試驗(yàn)、Lachman征陰性。將兔隨機(jī)分為正常組、模型組和移植組各20只，另養(yǎng)2只兔備用以保證數(shù)據(jù)的完整性，所有操作符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 前交叉韌帶損傷模型制備 將模型組和移植組兔固定在動物固定架上，耳緣靜脈注射3.3%的戊巴比妥鈉進(jìn)行全麻；右前肢關(guān)節(jié)處做脫毛處理，肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。用手術(shù)刀在右前肢的膝關(guān)節(jié)髕旁內(nèi)側(cè)做縱切口，切斷前交叉韌帶，暴露股骨和脛骨附著點(diǎn)。分離趾長伸肌腱并切斷遠(yuǎn)端，完整保留股骨端附著處，用4-0 Ethibond 縫合線縫合斷端。測量并記錄肌腱直徑，使用與之匹配的鉆通過前交叉韌帶在股骨和脛骨的附著點(diǎn)，建立股骨和脛骨隧道。在兔脛骨嵴上鉆孔，使膝關(guān)節(jié)屈曲30°，拉入趾長伸肌腱，在脛骨橋上打結(jié)固定。術(shù)后無動物死亡，1只感染，備用補(bǔ)充保證樣本量。

1.2.3 兔自體移植用BMSC的獲取與制備 參考孫經(jīng)淞等[3]的培養(yǎng)方法，并作適當(dāng)修改。在無菌條件下，抽取移植組兔骨髓5 mL，以1 500 r/min離心5 min，將分離的細(xì)胞接種于盛有低糖DMEM培養(yǎng)液的50 mL培養(yǎng)瓶(細(xì)胞密度5×105/cm2)中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底90%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶。將3 mL DMEN液注入生物蛋白膠，充分溶解后密封在EP管中，每支EP管裝有液體200 μL，-50 ℃冰箱保存。把2 mL纖維蛋白、0.5 mL凝血酶和2 mL細(xì)胞懸液混合成有固體強(qiáng)度的生物蛋白膠，再加入適量DMEM液，繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中觀察。

1.2.4 細(xì)胞移植 模型成功建立后，收集第3代BMSC約1×107，以1 500 r/min離心10 min；棄上清液，取底部的細(xì)胞團(tuán)，與200 μL的纖維蛋白原混合均勻；用兩支2.5 mL的空針分別抽取細(xì)胞懸液和催化劑，同連接器相連，將細(xì)胞注入移植組的脛骨和股骨隧道內(nèi)。以同樣方法在模型組脛骨和股骨隧道內(nèi)注入生物蛋白膠，正常組不做任何處理。治療期間，各組動物均自由飲食。

1.2.5 血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4檢測 術(shù)后第2、4、6、8周清晨抽取空腹后肢脛部皮下靜脈血5 mL，迅速轉(zhuǎn)移至生化管內(nèi)，以2 500 r/min離心15 min。移取上清液，-50 ℃冰箱保存待檢。采用SABC法檢測u-PA，ELISA法檢測TGF-β、IL-1、IL-4，嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.6 前交叉韌帶力學(xué)測定 術(shù)后各時(shí)點(diǎn)采血后每組分別處死5只，留取右前肢的膝關(guān)節(jié)；用生理鹽水紗布包裹立即送生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用WDW-100微機(jī)控制電子萬能生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測試。固定好待測部位后，以5 mm/min的速度進(jìn)行最大載荷拉伸試驗(yàn)，記錄前交叉韌帶完全斷裂時(shí)的加載負(fù)荷。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平比較 術(shù)后2、4、6、8周時(shí)，移植組和模型組血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平逐漸降低，并向正常組水平趨近；術(shù)后同一時(shí)點(diǎn)血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4比較，模型組>移植組>正常組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平比較

注：與同時(shí)點(diǎn)正常組比較，aP<0.05；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)前交叉韌帶再次斷裂所需拉力比較 術(shù)后2、4、6、8周，移植組和模型組前交叉韌帶再次斷裂所需拉力均逐漸增大，并向正常組水平趨近；術(shù)后同一時(shí)點(diǎn)前交叉韌帶再次斷裂所需拉力比較，模型組<移植組<正常組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)前交叉韌帶再次斷裂所需拉力比較

注：與同時(shí)點(diǎn)正常組比較，aP<0.05；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，bP<0.05。

3 討論

隨著社會的不斷發(fā)展，發(fā)生交通事故和參加體育鍛煉的人數(shù)增加，韌帶損傷發(fā)生率也逐年增加，且大多數(shù)為膝部韌帶損傷[4]。其中，90%的膝部韌帶損傷發(fā)生在前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，前交叉韌帶是最易受傷的韌帶，占膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的一半以上。前交叉韌帶損傷后不能自愈，需通過手術(shù)才能恢復(fù)其功能[5]。MSC是胚胎發(fā)育過程中在多種成體間葉組織(如骨髓基質(zhì)、胎盤、臍帶血等)中留存下來的未分化的原始多能細(xì)胞，具有長期自我更新和發(fā)生多向分化的潛能[6]。自體BMSC移植是自身抽取留存于骨髓中的MSC，經(jīng)培養(yǎng)、純化后再次注入患者體內(nèi)，是一種用于治療免疫性疾病的前沿療法[7，8]。

纖維蛋白組織的形成屬于一種病理現(xiàn)象，在血液凝結(jié)、血栓形成、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)中起重要作用。在皮膚和骨組織的修復(fù)中均能觀察到纖維蛋白組織的形成，其形成和降解之間存在著一種動態(tài)平衡，纖維蛋白溶酶對纖維蛋白的降解起到一定調(diào)控作用[9]。u-PA對纖維蛋白溶酶原有水解作用，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶，還參與炎癥反應(yīng)和基質(zhì)的降解過程[10]。本研究顯示，移植組血清u-PA低于同時(shí)點(diǎn)模型組，且逐漸接近正常組水平。這提示自體BMSC移植可促進(jìn)大白兔損傷處的恢復(fù)，使損傷處的微環(huán)境逐漸恢復(fù)平穩(wěn)狀態(tài)，u-PA的表達(dá)也逐漸向正常水平趨近。TGF-β是由兩條蛋白質(zhì)鏈組成的二聚體，兩個(gè)亞單位的結(jié)構(gòu)相似，由二硫鍵連接[11]。TGF-β可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，調(diào)節(jié)組織液的產(chǎn)生，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，加速細(xì)胞分化以及成熟，促進(jìn)肌腱、骨創(chuàng)傷處的愈合[12，13]。本研究顯示，移植組血清TGF-β低于同時(shí)點(diǎn)模型組，且逐漸接近正常組水平。這可能是損傷處內(nèi)環(huán)境逐漸恢復(fù)正常，肌腱和軟骨逐漸恢復(fù)正常，對TGF-β的調(diào)節(jié)需求減弱，TGF-β逐漸降低。

IL-1主要來自單核巨噬細(xì)胞，也可以來自軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等。其本質(zhì)是一種多肽，有激素樣作用。IL-1可以調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，增加代謝因子的表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解，致使軟骨退化[14]。本研究顯示，移植組注入BMSC和生物蛋白膠的混合物后，其血液中單核巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞對IL-1的表達(dá)水平逐漸趨于正常，損傷處的軟骨基質(zhì)降解減少，損傷處在不斷恢復(fù)。IL-4來源于T淋巴細(xì)胞，可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的有絲分裂，并增強(qiáng)B細(xì)胞提呈抗原能力，增加免疫系統(tǒng)對小量抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)[15]。IL-4還可以與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子發(fā)生協(xié)同作用，促進(jìn)骨髓造血前體細(xì)胞有絲分裂，對髓樣細(xì)胞定向分化有誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，移植組注入BMSC和生物蛋白膠的混合物后，損傷處細(xì)胞表達(dá)活動逐漸趨于正常，T淋巴細(xì)胞對其表達(dá)逐漸減少，損傷處在不斷恢復(fù)。

治療后定期測量前交叉韌帶損傷處再次斷裂所需拉力，可以代表損傷處的恢復(fù)情況。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后同一時(shí)點(diǎn)前交叉韌帶再次斷裂所需拉力比較移植組大于模型組。這提示自體BMSC移植后損傷處細(xì)胞分裂增殖速度增加，腱骨界面膠原纖維數(shù)量增加，肌腱強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因此，兔自體BMSC移植可有效修復(fù)前交叉韌帶損傷，并可有效降低兔血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平，對前交叉韌帶損傷的手術(shù)恢復(fù)有重要參考價(jià)值。