MiR-193b在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義

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(南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421001)

肝癌即肝細(xì)胞癌，是肝臟中最常見的腫瘤，發(fā)病率高，死亡率在各種惡性腫瘤中占第二位，對(duì)人類健康危害極大。microRNAs(miRNAs)是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致其翻譯過程受到抑制或引起mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平特異性影響靶基因表達(dá)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs失調(diào)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。MiR-193b的編碼基因位于人第16號(hào)染色體p13.12上，在非小細(xì)胞肺癌、食管鱗癌組織中呈低表達(dá)[4-5]。本課題組前期研究表明，miR-193b通過caspase-3途徑降低HepG2細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[6]，提示這種miRNA具有抗肝癌作用。然而，miR-193b在肝癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系仍不清楚。本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)miR-193b在肝癌組織及相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)，從而探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料40例原發(fā)性肝癌組織及相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織標(biāo)本均為本院2008年1月～2011年12月手術(shù)切除后的經(jīng)石蠟塊保存的組織標(biāo)本，并經(jīng)病理檢測(cè)確定，所有病例術(shù)前未行化療和放療，亦未合并其它系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)檔案室患者病歷資料，按年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分類，并記錄5年內(nèi)的生存情況。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)征得患者或者其家屬的知情同意。

1.2主要試劑Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix分別由美國Promega公司、上海生工生物工程公司、日本 Toyobo公司提供。

1.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 采用Trizol試劑提取組織標(biāo)本中的總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.22設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所使用的引物，并由華大基因生物科技有限公司合成，序列如下：miR-193b正義：5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′，反義：5′-CTGTGCGTGTGACAG CGGCTGA-3′；以U6為內(nèi)參， U6引物為：正義：5′-CTCG CTTCGGCAGCACA-3′，反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。在Roach480 qRT-PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性15 s，55℃復(fù)性30 s，70℃延伸30 s，總共40個(gè)循環(huán)。利用ΔΔCt值法定量目的基因miR-193b表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)設(shè)置陰性、陽性對(duì)照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過SPSS14.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存率分析利用Kaplan-Meier法，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-193b在肝癌組織中的表達(dá)利用qRT-PCR檢測(cè)miR-193b在肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，其qRT-PCR的溶解曲線見圖1，從曲線上分析，各個(gè)標(biāo)本的熔點(diǎn)基本上都集中在89℃左右，可以認(rèn)為qRT-PCR的特異性較好，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織miR-193b表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，差異有顯著性(t=5.32,P<0.01)(圖2)。

圖1 miR-193b的qRT-PCR的溶解曲線

圖2 兩組miR-193b表達(dá)水平比較 與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2 miR-193b表達(dá)與肝癌臨床病理特征分析為了進(jìn)一步探討miR-193b與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以中位數(shù)為界值(1.68)將其分為miR-193b低表達(dá)組(≤中位數(shù))和miR-193b高表達(dá)組(>中位數(shù))，分別包括16、24個(gè)樣本。如表1所示，miR-193b表達(dá)與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05)。

表1 miR-193b表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表

臨床參數(shù)nmiR-193b表達(dá)高(n=16)低(n=24)χ2PTNM分期 I+II18101526.53<0.05 III+IV2266淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無1371621.46<0.05 有2795

2.3 miR-193b表達(dá)與肝癌患者生存的關(guān)系對(duì)40例肝癌患者術(shù)后生存狀況進(jìn)行分析，相對(duì)于miR-193b低表達(dá)組，miR-193b高表達(dá)組患者5年生存率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.38,P<0.05)，見圖3。

圖3 肝癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差，其發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染及黃曲霉素、酒精、亞硝胺類物質(zhì)的長期攝入相關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。肝癌發(fā)病隱匿，許多患者確診時(shí)已到中、晚期，由于已發(fā)生局部腫瘤廣泛浸潤和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而喪失了最佳的治療時(shí)機(jī)。近年來，盡管已采取包括手術(shù)、放化療在內(nèi)的積極治療措施，5年生存率仍達(dá)不到預(yù)期水平，同時(shí)具有較高的復(fù)發(fā)傾向[7]。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制并從中找出有效的分子標(biāo)記物對(duì)于早期診斷、改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組時(shí)代的來臨，包括miRNAs在內(nèi)的非編碼RNA已成為生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一。作為一種多效性因子，miR-193b在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、自噬及血管生成等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-193b在腫瘤形成和發(fā)展中具有多重功能，扮演著抑癌基因的角色。例如，Hulin，等[8]用miR-193b mimic處理乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外源性給予miR-193b拮抗細(xì)胞遷移及新生血管形成。下調(diào)miR-193b表達(dá)則增加尿激酶型纖溶酶原激活物水平，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[9]。Zhang，等[10]報(bào)道，miR-193b在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞A2780增殖，并增加紫杉醇化療敏感性。在敲除頭頸鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系的 miR-193b基因后，細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯提高[11]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，miR-193b通過靶向沉默髓細(xì)胞白血病基因-1抑制肝癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-193b 表達(dá)水平較癌旁非腫瘤組織降低；miR-193b表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤大小無相關(guān)性；miR-193b高表達(dá)組患者5年生存率明顯高于miR-193b低表達(dá)組，這些結(jié)果表明miR-193b可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用，可作為評(píng)估腫瘤惡性程度及判斷預(yù)后的分子標(biāo)記物，但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。隨著研究的深入，miR-193b可望成為肝癌防治的一個(gè)潛在的、有價(jià)值的靶點(diǎn)。