慢性阻塞性肺疾病的早期診斷生物標志物初篩

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(1.廣州市第十二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510620；2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所 國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風險評價重點實驗室 廣東省水與大氣污染防治重點實驗室； 3.中國科學院廣州地球化學研究所 有機地球化學國家重點實驗室 廣東省環(huán)境資源 利用與保護重點實驗室；4.中國科學院大學；5.中國科學院城市環(huán)境研究所 中國科學院區(qū)域大氣環(huán)境研究卓越創(chuàng)新中心)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是全世界的常見多發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，每年導致全球超過三百萬人死亡，其中我國占一百多萬，已成為全球(特別是我國)的重要公共健康問題[1-7]。COPD的早期診斷和治療能顯著改善患者的生命質(zhì)量、降低死亡率，并減少其醫(yī)療費用。然而，當前COPD的診斷方法仍是傳統(tǒng)的肺功能檢查，但該方法存在不適用于所有年齡段的患者和無法進行早期診斷等諸多的局限性[8-10]。因此，突破傳統(tǒng)診斷方法的局限性，發(fā)展新的COPD早期診斷方法則顯得十分重要。

人體呼出氣體中的揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds, VOCs)攜帶大量的生理和病理信息，因此，基于呼出氣VOCs分析將可為COPD的診斷提供有效的生物標志物，從而為快速評估疾病狀態(tài)提供新的方法學支持[11]。但目前有關于COPD呼吸氣診斷方面的研究相對較少，且存在：(1)主要采用離線采樣和離線分析，無法滿足快速診斷的要求；(2)前期研究結(jié)果千差萬別，至今沒有獲得普適性的生物標志物等局限性[9, 12-18]。因此，本研究利用在線分析儀器質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應-飛行時間質(zhì)譜儀(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)對比檢測與分析15例COPD患者和50位與之匹配的健康者的吸入氣和呼出氣中VOCs的組分及濃度，期望獲得更多的COPD的生物標記物，豐富生物標記物庫，為建立COPD呼吸氣早期診斷的方法提供基礎科學數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料本研究招募了65名志愿者：15例COPD患者和50位與之匹配的對照健康者。15例患者為廣州市第十二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的COPD患者。所有受試患者均經(jīng)臨床診斷確認患有COPD，符合慢性阻塞性肺疾病全球倡議(global initiative for chronic obstructive lung disease, GOLD)標準[19]。根據(jù)GOLD指導方針，受試患者中5例被診斷為輕度或中度COPD(GOLD階段I/II)，10例被診斷為重度或極重度COPD(GOLD階段III/IV)。在呼吸氣樣品采集前，所有受試者依據(jù)國際GOLD指南推薦的呼吸量測定法，進行肺功能檢查來確定患者的COPD發(fā)展階段，主要的分析參數(shù)包括一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 1 second, FEV1)、FEV1%預測值、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)和FEV1/FVC。本研究獲得廣州市第十二人民醫(yī)院倫理委員會批準。所有受試者均自愿簽署知情同意書和填寫個人信息表，具體包括性別、年齡、身高、體重、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、吸煙喝酒狀況和個人及家族的過去病史。COPD患者和健康對照組的基礎數(shù)據(jù)見表1。

表1 COPD患者和健康對照組的基礎數(shù)據(jù)

1.2主要儀器與裝置肺功能測定儀(型號： MICRO QUARK；廠家：COSMED the Metabolic Company，羅馬，意大利)；2L泰德龍采氣袋(廠家：大連德霖氣體包裝有限公司，大連，中國)；質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應-飛行時間質(zhì)譜儀(型號：PTR-TOF 2000；廠家：Ionicon Analytik GmbH，因斯布魯克，奧地利)。

1.3呼吸氣采集和分析在采集呼吸氣樣品之前，所有受試者被要求在采樣前至少一個小時內(nèi)不能吸煙、吃食物、喝飲料(除水以外)和刷牙，并用純凈水漱口。其中，受試患者還須在采樣前24小時停止使用長效支氣管擴張劑或12小時停止吸入短效支氣管擴張劑和糖皮質(zhì)激素。

使用2L泰德龍采氣袋采集每位受試者的一個吸入氣(即周圍環(huán)境空氣)樣品和兩個呼出氣樣品。吸入氣采集是使用玻璃注射器將受試者周圍環(huán)境空氣注入氣袋中；而呼出氣采集則是通過一段特氟龍管由受試者將肺部氣體經(jīng)口腔多次吹入采氣袋，且選擇采集呼出潮氣末期的氣體樣品。所有樣品均在室溫下保存，樣品采集后2 h內(nèi)完成分析。

1.4質(zhì)量保證和質(zhì)量控制本研究應用PTR-TOF Data Analyzer(version 4.49)軟件處理實驗數(shù)據(jù)[20]，選用水合氫離子同位素(H318O+,m/z21.022)、水團簇離子同位素(H518O16O+;m/z39.033)、質(zhì)子化的丙酮((C3H6O)H+;m/z59.049)和質(zhì)子化的1,2,4-三氯苯((C6H3Cl3)H+,m/z180.937)進行質(zhì)量校準。標準曲線的線性相關系數(shù)R2均大于0.997。各化合物的靈敏度，即標準化的信號響應(normalized counts per second, ncps)與其對應濃度水平(part per billion by volume, ppbv)，在10.51～40.08 ncps/ppbv之間。本研究中標準曲線的斜率即為靈敏度，也是校正因子[21]。方法檢測限在0.039～0.086 ppbv之間，分析儀器的精密度(相對標準偏差)小于7%，準確度在±13%之間。

考慮吸入氣和呼出氣中濕度的巨大差異對目標化合物信號響應的影響，本研究應用de Gouw等[22]建議的方法計算生成物離子信號標準化響應。根據(jù)Stockwell等[21]和Sarkar等[23]提議的質(zhì)量相關的靈敏度計算法，對本研究報道的但標氣不含有的化合物進行定量計算。

1.5統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示。當數(shù)據(jù)通過正態(tài)性檢驗(P>0.05)時，t檢驗被用于檢驗兩類獨立樣本的統(tǒng)計性差異。而當正態(tài)分布、方差齊性不能達到t檢驗的要求時，則使用非參數(shù)檢驗方法：曼-惠特尼U檢驗。雙尾顯著性檢驗被用于檢驗研究結(jié)果，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD患者與健康對照組呼出氣對比本研究從質(zhì)譜圖中共提取出285個質(zhì)量峰。首先，篩選出內(nèi)源VOCs，當某化合物在呼出氣中濃度高于吸入氣中濃度，則該化合物可能是內(nèi)源化合物，會被選為候選生物標記物。然后，為了消除環(huán)境因素影響，候選標志物顯示的濃度均是呼出氣濃度減去吸入氣濃度的結(jié)果。最后，通過統(tǒng)計分析COPD患者與健康對照組呼出氣VOCs濃度，發(fā)現(xiàn)18種VOCs在這兩類人群中差異具有顯著性(P<0.05，表2)。因此，這18種VOCs被確定為COPD呼出氣的生物標志物，它們分別是丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、乙酸、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、環(huán)己二烯、戊烯醛、2-甲基丁醛、乙酸乙酯、丁酸、苯酚、二甲基苯甲醛、3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(羅勒烯)和松油醇。

表2 COPD患者與健康對照組呼出氣VOCs標志物 的濃度及P值統(tǒng)計

此外，丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者和健康志愿者之間具有更高水平的顯著性差異(P<0.001)，它們的濃度在COPD患者和健康對照組之間沒有重疊交集。因此，上述7種VOCs被認為是顯著的COPD生物標志物。

2.2 COPD早期與晚期患者呼出氣對比統(tǒng)計分析顯示COPD早期(包括輕度和中度)與晚期(包括重度和極重度)患者的呼出氣標志物濃度差異無顯著性(P>0.05，表3)。

3 討論

COPD是全世界的常見多發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，每年導致全球超過三百萬人死亡[24]。尤其是在我國，COPD更為盛行，從1990年～2013年它一直高居全國第三大致死病因，每年大約一百萬人死于該病，約占全球COPD死亡人數(shù)的三分之一[3-4]。早期診斷和治療是改善COPD患者的生命質(zhì)量、延長壽命、降低死亡和降低醫(yī)療費用的關鍵。然而早期COPD呼吸癥狀在臨床表現(xiàn)不明顯，現(xiàn)行的肺功能檢查不能對該階段疾病做出全面準確的診斷[9]。因此，發(fā)展一種非侵入性且快捷的COPD早期診斷方法，則具有十分重要的實際應用意義?；诤舫鰵釼OCs生物標志物分析的COPD診斷方法具備上述的優(yōu)點，將是一種全新的評估COPD手段，從而為COPD的早期診斷提供新的思路。

表3 COPD早期與晚期患者呼出氣VOCs標志物 的濃度及P值統(tǒng)計

本研究通過對比分析獲得18種COPD的特征性呼氣生物標志物，其中有5種化合物與前人的研究一致：羅勒烯和松油醇與Van Berkel等[12]研究發(fā)現(xiàn)一致；2-甲基丁醛則被Cristescu等[13]認為是肺氣腫(COPD晚期癥狀)的生物標志物；乙酸和苯酚則分別為Phillips等[14]及Gaida等[15]提出為COPD呼出氣生物標志物；Allers等[16]在兩種檢測儀器中均發(fā)現(xiàn)的生物標志物：2-戊酮與本研究現(xiàn)的生物標志物2-甲基丁醛是同分異構(gòu)體，它們分子質(zhì)量均為86 amu。上述5種化合物可確定為COPD患者呼出氣的特征性生物標志物，應用于COPD的診斷。

本研究首次報道的13種COPD患者呼出氣特征性化合物：丙炔、丙烯、乙醛、乙醇、甲基乙烯基酮(methyl vinyl ketone, MVK)/甲基丙烯醛(methylacrolein, MACR)/丁烯醛、丁酮/正丁醛、丁胺、丙酸、環(huán)己二烯、戊烯醛、乙酸乙酯、丁酸和二甲基苯甲醛，特別是其中的丙炔、乙醛、丁酮/丁醛、丁胺、2-甲基丁醛、乙酸乙酯和丁酸在COPD患者與健康者之間具有極顯著性差異(P<0.001，表2)，具有作為COPD診斷生物標志物的潛在價值，但由于本研究招募到的COPD患者數(shù)不多，尚需進一步的深入研究。

此外，本研究獲得的18種COPD生物標志物在COPD早期與晚期階段濃度無顯著性差異，表明這些標志物的濃度不會隨著COPD的惡化程度而發(fā)生變化，但與健康者比較具有顯著性的差異。因此，它們具有應用于COPD早期診斷的價值。

本研究的不足之處：實驗中患病受試者數(shù)目相對較少，僅有15名受試者。后續(xù)我們將招募更多的COPD患者與健康對照者，從而提供更加可靠的統(tǒng)計分析結(jié)果。

綜上所述，本研究初步篩選得到18種COPD患者的呼氣特征性化合物，豐富了COPD呼出氣的生物標志物庫，其中5種與不同研究者基于不同國家或地區(qū)人群數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致，具有應用于COPD早期診斷的價值。13種新報道的化合物具有應用于COPD早期診斷的潛在價值，尚需后續(xù)進一步的研究證實。