干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)肺損傷大鼠模型肺功能保護(hù)及機(jī)制研究

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(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院老年科,江蘇 淮安 223300)

肺損傷是由于受到肺內(nèi)外某些因素直接或間接的損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞或者肺泡的上皮細(xì)胞，使肺部的血管通透性增加，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎癥因子，引起組織損傷[1-2]。近年來(lái)對(duì)干細(xì)胞的研究和應(yīng)用成為許多疑難雜癥，如缺血性疾病，肺、腦損傷的有效治療方式。在穩(wěn)定狀態(tài)下人類(lèi)外周血中存在很低水平的干細(xì)胞并且大多處于靜息狀態(tài)，在炎癥后其可遷移至非造血器官。在應(yīng)急反應(yīng)發(fā)生時(shí)，一些應(yīng)急信號(hào)，如注射粒細(xì)胞集落刺激因子，會(huì)增加干細(xì)胞的釋放，對(duì)受損的組織進(jìn)行恢復(fù)。粒細(xì)胞集落刺激因子是目前最常用，效果明顯的干細(xì)胞動(dòng)員劑之一，在受損組織的恢復(fù)功能中發(fā)揮著重要作用[3]。本文通過(guò)皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子治療博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷大鼠模型，探討了干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制，為干細(xì)胞動(dòng)員防治肺損傷提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)及處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》及《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)》的相關(guān)規(guī)定。

主要試劑：博來(lái)霉素(日本化藥株式會(huì)社)；重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)(齊魯制藥)；戊巴比妥鈉 (天津市化學(xué)試劑六廠)；4%多聚甲醛固定液(上海歌凡)；蘇木精-伊紅染色液(北京索萊寶)；腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司)；白細(xì)胞介素(IL)-1βELISA試劑盒(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司)；白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司)。

主要儀器：光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；多樣品組織研磨機(jī)-24(天津科萊恩)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；-80℃冰箱(海爾)；注射器等。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及模型的建立[4]雄性wistar大鼠30只，隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組和動(dòng)員組各10只。正常組正常飼養(yǎng)，不做處理，對(duì)照組、動(dòng)員組大鼠經(jīng)氣管注入5mg·kg-1博來(lái)霉素0.2～0.3mL 誘發(fā)建立肺損傷模型，大鼠明顯出現(xiàn)呼吸加快,淺促。動(dòng)員組于模型建立后即刻皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子30μg·kg-1·d-1，連續(xù)7天；對(duì)照組于模型建立后即刻皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)7天。7天后注射3%戊巴比妥鈉1mg·kg-1過(guò)度麻醉處死。

1.3觀察肺組織病理改變?nèi)〔糠钟曳蜗氯~用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理改變。

1.4肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)測(cè)定取部分右肺以10mL生理鹽水灌洗3次，收集灌洗液，離心800r·min-1，5min，收集上清液放入-80℃冰箱保存。

1.5肺組織的濕干比測(cè)定取右肺上葉組織以生理鹽水沖洗表面血液，用濾紙吸干肺臟表面附著液體，稱質(zhì)量為肺濕質(zhì)量，在80℃烘箱中干燥過(guò)夜，再次稱質(zhì)量為肺干質(zhì)量，計(jì)算兩次肺組織質(zhì)量之比，即肺組織的濕干比。

1.6肺組織勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、白細(xì)胞介素(IL)-6的測(cè)定取大鼠左肺組織按1g肺組織加5mL生理鹽水比例制成勻漿，行ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)改變正常組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間隔完整；對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增厚，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；動(dòng)員組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，但較正常組間隔仍增厚，肺組織損傷明顯減輕。

圖1 A、B、C分別為各組大鼠肺組織HE觀察結(jié)果(200×)注：A為正常組，B為對(duì)照組，C為動(dòng)員組。

2.2各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)和肺組織濕干比的差異比較與正常組相比，動(dòng)員組和對(duì)照組肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)均高于正常組(P<0.05)，對(duì)照組的肺組織濕干比高于正常組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，動(dòng)員組肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)和肺組織濕干比均低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞和肺組織 濕干比的差異比較

與正常組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05

圖2 各組大鼠肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)

圖3 各組大鼠肺細(xì)胞濕干比

2.3各組大鼠肺組織勻漿中細(xì)胞因子含量檢測(cè)結(jié)果與正常組相比，對(duì)照組的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、白細(xì)胞介素(IL)-6的表達(dá)水平均高于正常組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，動(dòng)員組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05)。

表2各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平比較(pg/mL)

分組nTNF-αIL-1βIL-6正常組10108.33±13.78208.93±13.02127.34±11.46對(duì)照組10365.79±26.02a532.61±20.37a386.76±15.26a動(dòng)員組10145.36±9.27b304.05±15.96ab187.83±12.58b

注：與正常組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05

圖4 各組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子水平

3 討論

肺損傷，就是指肺部的損傷，有各種表現(xiàn)，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到許多細(xì)胞活動(dòng)，分為早期的組織損傷和晚期的損傷后恢復(fù)[5]，初步認(rèn)為肺損傷是以血管為中心的，以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等等反應(yīng)為主的炎癥過(guò)程[6]，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。用博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷模型，起初主要的癥狀為破壞肺泡細(xì)胞，毛細(xì)血管壁通透性增加使炎性細(xì)胞因子浸潤(rùn)，之后轉(zhuǎn)化為肺部纖維化，肺組織功能受損[8]。

目前治療肺損傷的方法主要是呼吸維持及抗炎用藥，但效果不是很好，而干細(xì)胞動(dòng)員作為一種新的治療方法受到了廣泛關(guān)注。

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。近些年來(lái)，隨著對(duì)干細(xì)胞分化潛能的研究，使干細(xì)胞在防治某些損傷性疾病和造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病中的治療作用得到很大促進(jìn)，并發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞能修復(fù)受損肺組織的結(jié)構(gòu)和功能。干細(xì)胞動(dòng)員劑可以使骨髓造血細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、充質(zhì)干細(xì)胞同時(shí)動(dòng)員，從而使骨髓的多種干細(xì)胞動(dòng)員參與受損組織的恢復(fù)[9]，其中粒細(xì)胞集落刺激因子是骨髓干細(xì)胞最強(qiáng)的動(dòng)員劑之一。當(dāng)機(jī)體受損或有炎癥時(shí)，單一或多重的應(yīng)急信號(hào)可干擾穩(wěn)態(tài)造血，導(dǎo)致骨髓中成熟和不成熟的造血細(xì)胞向外周循環(huán)的釋放增加，骨髓釋放干細(xì)胞至循環(huán)并遷移至損傷部位，來(lái)構(gòu)成機(jī)體防御和組織修復(fù)。而肺內(nèi)有多種干細(xì)胞，肺組織受損后由于內(nèi)源性干細(xì)胞的存在使肺具有一定再生能力，外源性的干細(xì)胞也在受損組織處分化為肺功能細(xì)胞，具體機(jī)制還有待研究[10]。

正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體的炎癥因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體遇到刺激時(shí)平衡狀態(tài)被打破，若炎性因子過(guò)表達(dá)，就會(huì)造成機(jī)體損傷。當(dāng)發(fā)生創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，大量炎癥因子產(chǎn)生如TNF-α、IL-1β、IL-6等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，加重肺損傷。

TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活后產(chǎn)生，能直接損傷組織器官，在炎癥的發(fā)生中起著起始作用而誘導(dǎo)其他炎性因子的釋放。TNF-α可以使中性粒細(xì)胞大量釋放，增加血管通透性，促使IL-1β、IL-6等炎性因子釋放生成量增多，加重炎癥反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)程。白細(xì)胞介素由多種細(xì)胞產(chǎn)生，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答，參與機(jī)體的生理病理過(guò)程，在干細(xì)胞動(dòng)員中具有調(diào)節(jié)作用。IL-1β由多種類(lèi)型細(xì)胞分泌，參與介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，它能有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷組織遷移[11]。IL-1β也能促進(jìn)TNF-α、IL-6的生成。IL-6可由多種細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)干細(xì)胞分化，刺激造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，促進(jìn)干細(xì)胞向受損的組織遷移，歸巢，并轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞[12]。

干細(xì)胞具有減輕炎癥反應(yīng)的功能，通過(guò)再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡抗氧化等[13]。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子在肺損傷中明顯增高，可通過(guò)增加肺泡毛細(xì)血管的通透性而增加肺組織含水量[14]。而移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向受損的組織聚集分布，抑制TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)修復(fù)肺組織，治療重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠[15]。此前有研究報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)皮下注射rhG-CSF進(jìn)行骨髓干細(xì)胞動(dòng)員能夠使急性肺損傷大鼠的IL-1β和TNF-α等炎性因子的表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)肺組織損傷的修復(fù)。

肺組織濕干比，即肺水含量，被稱為水腫的指標(biāo)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，而水腫是炎癥的典型表現(xiàn)。在本研究結(jié)果中，與正常組相比，對(duì)照組的肺組織濕干比高于正常組(P<0.05)；動(dòng)員組肺組織濕干比均低于對(duì)照組(P<0.05)。肺損傷是一種全身炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生病理炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)激活中性粒細(xì)胞的釋放，導(dǎo)致促炎因子釋放，擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇損傷的發(fā)生發(fā)展。在本研究結(jié)果中，與正常組相比，動(dòng)員組和對(duì)照組肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)均高于正常組(P<0.05)，與對(duì)照組相比，動(dòng)員組肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組(P<0.05)；肺組織勻漿中對(duì)照組和動(dòng)員組TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平均明顯高于正常組(P<0.05)，動(dòng)員組低于對(duì)照組(P<0.05)，提示TNF-α、IL-1β、IL-6參與了肺損傷的病理過(guò)程，并且加劇的損傷的嚴(yán)重程度，而干細(xì)胞動(dòng)員能有效保護(hù)肺損傷，具有一定的臨床意義。

大鼠體內(nèi)注入博來(lái)霉素可使肺組織受損，進(jìn)而炎細(xì)胞浸潤(rùn)，TNF-α、IL等大量產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)中在注射博來(lái)霉素后注射重組人粒細(xì)胞刺激因子，結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞數(shù)減少，肺組織濕干比降低，肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，表明干細(xì)胞動(dòng)員可以抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)肺功能促使其恢復(fù)。干細(xì)胞其對(duì)受損組織再生修復(fù)的功能這一新的研究越來(lái)越受到廣大學(xué)者的重視，相信不遠(yuǎn)的將來(lái)會(huì)有重大突破。