人臍帶間充質干細胞對急性肺損傷大鼠的血清炎性 因子及肺組織TRB3 mRNA表達

(南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科,江蘇 淮安 223300)

急性肺損傷是呼吸內科常見病、多發(fā)病，其是由意外創(chuàng)傷、微生物感染、化學試劑等引起的，以進行性呼吸困難、肺組織急性病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的肺部疾病[1]。研究表明急性肺損傷時,體內多種炎癥因子激活，進一步加重肺部損傷[2]。目前關于急性肺損傷尚未發(fā)現(xiàn)有效治療手段，患者往往預后不良。干細胞具有較強的分化潛能，能修復多種組織損傷[3]，急性肺損傷時肺組織內血管內皮、肺泡壁組織、肺泡毛細血管屏障均遭到破壞，體內白細胞介素6(interleukins-6，IL-6)、白細胞介素10(interleukins-10，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TGF-α)等炎癥因子水平顯著升高，促進炎癥反應、引起細胞程序性凋亡[4]。研究表明TRB3參與細胞凋亡及炎癥反應[5]，且TRB3與急性肺損傷相關研究較少，本研究旨在探究研究人臍帶間充質干細胞對急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 60只SD大鼠由長沙天勤生物技術有限公司提供，許可證號：scxk(湘)2014-0010，周齡4～6周，體重160～180g。將大鼠飼養(yǎng)在溫度21～25℃，濕度45～55%的空調房內，保持12小時晝夜節(jié)律，并保持提供充足的水和食物。

1.1.2 人臍帶間充質干細胞 人臍帶間充質干細胞來源于我院第一附屬醫(yī)院婦產科健康新生兒，產婦及家人均簽署之情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(hyclone)、胰酶(碧云天)、胎牛血清(Thermo Fisher公司，貨號：10099158)、脂多糖(LPS)(Solarbio公司貨號：L8880)、白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子試劑盒(南京信帆生物技術有限公司)、逆轉錄試劑盒( 美國ThermoFisherScientific公司)、實時熒光定量PCR試劑盒(Sigma-Aldrich)等。

1.1.4 主要儀器 SimpliAmpTMPCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、低溫高速離心機(Hermel公司)、PCR Lightcycler 480 儀器(羅氏診斷產品有限公司)等。

1.2方法

1.2.1 實驗動物分組及疾病模型構建[6]60只SD大鼠隨機分為以下3組(每組20只)：正常對照組，急性肺損傷模型組，干細胞治療組，飼養(yǎng)1周適應環(huán)境后，鼠尾消毒后急性肺損傷模型組和干細胞治療組鼠尾注射LPS(3 mg/kg)，正常對照組鼠尾注射同等體積生理鹽水，成模標準：12小時后，大鼠呼吸頻數(shù)增加，，出現(xiàn)呼吸窘迫，動脈血氧分壓/吸氧濃度<300mmHg即為造模成功。成模2小時后，C組予以氣管內滴注人臍帶間充質干細胞懸液0.1 mL(細胞溶液濃度2×107個/mL)，正常對照組、急性肺損傷模型組予以同體積生理鹽水滴注。

1.2.2 人臍帶間充質干細胞 人臍帶間充質干細胞來源于我院第一附屬醫(yī)院婦產科健康新生兒，產婦及家人均簽署之情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。胎兒臍帶去除動靜脈，PBS清洗后，手術剪剪碎臍帶至于15mL離心管內，向管內加入膠原酶3mL，靜至30min后，加入0.25%胰酶搖床上震蕩60 min加入培養(yǎng)基2 mL，去除肉眼可見大體積團塊，用80目細胞篩過濾2次后，將濾液裝入另一15mL離心管，2500 r/min離心15分鐘，棄去上清液。將細胞懸液至于配置好培養(yǎng)基內，擴增至第5代后用于氣管內滴注。

1.2.2 各組血清炎性因子水平測定 在造模成功并氣管滴注干細胞24小時后，抽取大鼠右側股靜脈血液2～5mL,將血液樣本標記后靜置2 h，2000r/min離心10分鐘后，取上清液，置于-20℃待用。血清白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TGFα)水平采用ELISA法測定，操作步驟嚴格遵循測試盒說明書。

1.2.3 各組肺組織TRB3 mRNA表達量測定 在造模成功并氣管滴注干細胞24小時后，每組取3只大鼠，處死后取右肺上葉肺組織100mg， 用RNA試劑盒提取RNA后，將RNA用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。用SybGreen I染料法測實時熒光定量PCR。TRB3上游引物、下游引物分別為：5′-TGATGCTGTCTGGATGACAA -3′，5′-GTGAATGGGGACTT TGGTCT -3′，內參為GAPDH，上游引物、下游引物分別為：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′， 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，逆轉錄cDNA產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，測量計算與GAPDH 積分光比值，即為各組肺組織TRB3 mRNA表達量。

1.2.4 各組肺組織濕/干質量比計算 在造模成功并氣管滴注干細胞24小時后，每組取3只大鼠，處死后取右肺上葉肺組織，生理鹽水小心快速沖洗后，濾紙輕柔擦拭表明殘余生理鹽水，稱量其質量即為肺濕質量(M)。其后將肺組織至于烤箱80℃烘干48 h，此時再次稱量其質量即為肺干質量(N)。肺組織濕/干質量比= M/N。

2 結果

2.1三組炎癥血清炎性因子水平比較用藥24小時后，檢測3組股靜脈血清IL-6、IL-10、TGFα水平，急性肺損傷模型組血清IL-6水平為(329.47±13.28)ng/L較正常對照組(165.35±15.23)ng/L 顯著升高(t=40.335，P<0.01)，干細胞治療組血清IL-6為(256.67±12.44)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(329.47±13.28)ng/L(t=36.322，P<0.01)，說明人臍帶間充質干細胞可降低血清IL-6水平，見圖1。急性肺損傷模型組血清IL-10水平為(415.44±12.37)ng/L較正常對照組(142.55±13.25)ng/L 顯著升高(t=67.325，P<0.01)，干細胞治療組血清IL-10為(280.76±11.47)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(415.44±12.37)ng/L(t=35.704，P<0.01)，說明人臍帶間充質干細胞可降低血清IL-10水平，見圖2。急性肺損傷模型組血清TGF-α水平為(157.88±10.56)ng/L較正常對照組(27.56±8.33)ng/L 顯著升高(t=43.331，P<0.01)，干細胞治療組血清TGFα為(78.26±9.53)ng/L顯著低于急性肺損傷模型組(157.88±10.56)ng/L(t= 25.032，P<0.01)，說明人臍帶間充質干細胞可降低血清TGFα水平,見圖3。

圖1 三組血清IL-6水平比較**P< 0.01

圖2 三組血清IL-10水平比較**P< 0.01。

圖3 三組血清TGFα水平比較**P< 0.01

2.2三組肺組織TRB3 mRNA表達量比較急性肺損傷模型組肺組織TRB3 mRNA(2.343±0.154)較正常對照組肺組織TRB3 mRNA(0.632±0.013)顯著升高(t=49.511,P<0.01)。干細胞治療組肺組織TRB3 mRNA(1.071±0.065)顯著優(yōu)于急性肺損傷模型組肺組織TRB3 mRNA(2.343±0.154)(t=34.031,P<0.01)。詳見圖4。

圖4 各組TRB3 mRNA表達量比較結果**P< 0.01。

2.3各組肺組織濕/干質量比比較研究結果顯示：急性肺損傷模型組肺組織濕/干質量比(6.56±0.21)較正常對照組肺組織濕/干質量比(3.38±0.12)顯著升高(t=58.798,P<0.01)。干細胞治療組肺組織濕/干質量比(3.98±0.28)顯著優(yōu)于急性肺損傷模型組肺組織濕/干質量比(6.56±0.21)(t=32.966,P<0.01)。詳見圖2由以上數(shù)據(jù)可知，急性肺損傷后，肺組織肺組織濕/干質量比增加，干細胞治療后肺組織肺組織濕/干質量比顯著降低，詳見圖5。

圖5 各組肺組織肺組織濕/干質量比情況**P< 0.01。

3 討論

急性肺損傷是呼吸內科常見病、多發(fā)病，其是由意外創(chuàng)傷、微生物感染、化學試劑等引起的，以進行性呼吸困難、肺組織急性病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的肺部疾病[7]。研究表明急性肺損傷時體內多種炎癥因子激活，進一步加重肺部損傷[8]。目前關于急性肺損傷尚未發(fā)現(xiàn)有效治療手段，患者往往預后不良[9]。干細胞具有較強的分化潛能，能修復多種組織損傷，急性肺損傷時肺組織內血管內皮、肺泡壁組織、肺泡毛細血管屏障均遭到破壞，體內白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平顯著升高，促進炎癥反應、引起細胞程序性凋亡[10]。研究表明TRB3參與細胞凋亡及炎癥反應[11]，且TRB3與急性肺損傷相關研究較少，本研究旨在探究研究人臍帶間充質干細胞對急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達影響。為人臍帶間充質干細胞治療急性肺損傷研究提供參考依據(jù)。

Liu DD等[12]發(fā)現(xiàn)脂多糖在誘導急性肺損傷時，起作用的活性成分主要為內毒素。內毒素可引起肺部炎癥反應，激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞釋放白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子，從而損傷肺泡上皮細胞，引起肺組織水腫，進而影響患者通氣水平、血氧濃度導致呼吸衰竭[13]。因此可根據(jù)血清白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子α等炎癥因子水平判斷急性肺損傷嚴重程度及預后療效。

本實驗表明在脂多糖誘導急性肺損傷24小時后，疾病組大鼠白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子α炎癥因子水平顯著升高，而人臍帶間充質干細胞移植組大鼠血清白細胞介素6、白細胞介素10、腫瘤壞死因子α炎癥因子水平較疾病組顯著下降，說明人臍帶間充質干細胞可緩解急性肺損傷炎癥水平。Wei K等[14]發(fā)現(xiàn)TRB3可由外部物理化學刺激誘導參與細胞凋亡，但具體涉及分子機制尚不清楚，可能與具體刺激原因及細胞類型有關。研究表明TRB3參與細胞多種生物代謝過程，其中包括細胞凋亡及炎癥反應，但目前TRB3與急性肺損傷研究較少[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在疾病組大鼠肺組織中TRB3 mRNA表達顯著高于正常對照組，在進行人臍帶間充質干細胞移植后，大鼠肺組織中TRB3 mRNA表達量明顯降低。且疾病組肺組織濕/干質量比顯著升高，也表明其疾病組大鼠肺組織水腫嚴重，在進行人臍帶間充質干細胞移植后肺組織濕/干質量比明顯降低。

綜上所述，人臍帶間充質干細胞可有效降低急性肺損傷大鼠的血清炎性因子及肺組織TRB3 mRNA表達水平，并減少肺組織濕/干質量比。