骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦動(dòng)脈栓塞大鼠VEGF165、 Notch1表達(dá)的影響

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(池州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 池州 247000)

動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)是指栓子沿血液循環(huán)進(jìn)入腦動(dòng)脈系統(tǒng)，引起動(dòng)脈管腔閉塞，致使該動(dòng)脈供血區(qū)局部腦組織的壞死。MCAO是威脅人類健康的一種疾病，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)腦內(nèi)血管生成是一種新的恢復(fù)腦梗死的治療手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是具有自我更新能力的一種細(xì)胞，可以多向分化為機(jī)體的各種細(xì)胞，其在體外誘導(dǎo)可以分化為神經(jīng)細(xì)胞[1]，在組織工程、基因工程、細(xì)胞移植方面有較好的臨床應(yīng)用前景，BMSCs移植是治療腦血管疾病一種新的治療方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦動(dòng)脈栓塞模型，觀察BMSCs移植后腦組織微血管密度(micro-vascular density，MVD)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)165、Notch1的表達(dá)，來(lái)探究BMSCs促進(jìn)血管新生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：45只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(260±20)g；10只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(90±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2011-0011。

主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、雙抗(Gibico，美國(guó))；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體(Preprotech，美國(guó))；小鼠抗大鼠Notch1抗體(Chemicon，美國(guó))；兔抗大鼠VEGF抗體(Preprotech，美國(guó))；辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；組織蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)。主要儀器：光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)；低溫高速離心機(jī)(Thermo，美國(guó))；PCR儀(ABI，美國(guó))；微量移液器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等。

1.2 BMSCs的分離培養(yǎng)[2]取體重為(90±10)g SD大鼠，分離其兩側(cè)的股骨，以使骨髓腔充分暴露，用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗后，將骨髓懸液過(guò)濾并離心，棄掉上清，將重懸的細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后棄掉沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液。在此之后每3天進(jìn)行1次換液，等到細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。取第4代的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)行移植。

1.3 MCAO模型的建立線栓法制作MCAO模型[3-4]。將大鼠按照1 mL/100 g腹腔注射4%的水合氯醛麻醉。大鼠固定后，在頸部正中切口，分離暴露出右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端、頸總動(dòng)脈近心端，夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈近心端剪一“V”形切口，將線栓插入距離頸總動(dòng)脈18 mm處時(shí)固定，縫合皮下組織，1個(gè)小時(shí)后拔線，縫合切口。大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征即為模型成功。

1.4 MCAO癱瘓程度評(píng)分動(dòng)物麻醉清醒后，參照Z(yǔ)ea Longa方法[3]，對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。1～3分者為納入本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，對(duì)于神經(jīng)損傷太重(4分)或太輕(0分)的老鼠棄之不用。

1.5實(shí)驗(yàn)分組BMSCs移植組：模型制作成功24小時(shí)后，將第4代的BMSCs細(xì)胞3×106個(gè)混懸于0.6 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，通過(guò)股靜脈勻速注入。MACO組，24小時(shí)后股靜脈勻速注入等量PBS。假手術(shù)對(duì)照組，只切開頸部皮膚暴露動(dòng)脈，不插線栓，24小時(shí)后股靜脈勻速注入等量PBS。各組再按不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為3組，每組5只。BMSCs移植后4天、7天、14天取材。

1.6 MVD檢測(cè)隨機(jī)選擇各組各時(shí)間點(diǎn)腦組織冰凍切片5張，按照免疫熒光染色法Ⅷ因子檢測(cè)法，每單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮簇為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本取2～3張切片，熒光顯微鏡下對(duì)微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)。用均值來(lái)作為微血管密度。

1.7 Western blot檢測(cè)VEGF165、Notch1蛋白表達(dá)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作來(lái)提取各組大鼠腦組織中的總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，加入相應(yīng)一抗兔抗大鼠VEGF抗體、小鼠抗大鼠Notch1抗體(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜、洗膜后加入二抗(稀釋倍數(shù)為1∶2 000)37 ℃孵育2 h，清洗后于暗室中滴加化學(xué)發(fā)光液顯影，于凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以β-actin蛋白作為內(nèi)參，各組目的條帶灰度值與內(nèi)參進(jìn)行比值為蛋白的表達(dá)相對(duì)量。

1.8 RT-PCR檢測(cè)VEGF165、Notch1 mRNA表達(dá)取大鼠腦組織提取總RNA，于PCR儀中行逆轉(zhuǎn)錄，按照預(yù)先設(shè)定熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，行瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶的吸光度(OD值)半定量分析。結(jié)果以目的基因的OD值比上β-actin的OD值來(lái)表示。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)變化原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈圓形，1天后即開始貼壁生長(zhǎng)，3天后可見細(xì)胞呈成纖維樣，5天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)增加，10天左右細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。傳代后，細(xì)胞增殖速度加快，隨著傳代代數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)多逐漸趨于一致較均一為長(zhǎng)梭形，并呈漩渦或束狀排列生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(200×)A：原代培養(yǎng)的細(xì)胞；B：呈成纖維樣生長(zhǎng)的貼壁干細(xì)胞； C：細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%；D：第4代干細(xì)胞

2.2各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織MVD分析在假手術(shù)組微血管計(jì)數(shù)幾乎很少，MCAO組、BMSCs組微血管數(shù)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，BMSCs移植后新生血管數(shù)量明顯增多(P<0.05，表1)。

表1 大鼠腦組織不同時(shí)間微血管計(jì)數(shù)

與假手術(shù)對(duì)照組，aP<0.05；與MCAO組，bP<0.05

2.3 Wsternblot檢測(cè)VEGF165、Notch1蛋白的表達(dá)MCAO組、BMSCs組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF165、Notch1蛋白表達(dá)均明顯高于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)，BMSCs移植后，表達(dá)更高(P<0.05)，在第14天各組蛋白表達(dá)開始下降(圖2、表2)。

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)VEGF165、Notch1蛋白的表達(dá)

分組VEGF1654天7天14天Notch14天7天14天假手術(shù)對(duì)照組0.019±0.0020.019±0.0030.018±0.0030.014±0.0020.014±0.0040.016±0.003MCAO組0.156±0.007a0.189±0.011a0.121±0.007a0.145±0.008a0.186±0.010a0.130±0.007aBMSCs組0.214±0.013ab0.298±0.014ab0.175±0.006ab0.202±0.012ab0.345±0.014ab0.183±0.008ab

與假手術(shù)對(duì)照組，aP<0.05；與MCAO組，bP<0.05

2.4 RT-PCR檢測(cè)VEGF165、Notch1 mRNA的表達(dá)

MCAO組、BMSCs組VEGF165、Notch1 mRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)，BMSCs移植后表達(dá)更高(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織VEGF165、Notch1 mRNA的表達(dá)(n=5)

與假手術(shù)對(duì)照組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05

3 討論

腦栓塞有較高的發(fā)病率及致死率，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能損害，隨著對(duì)干細(xì)胞移植這一領(lǐng)域的研究越來(lái)越多，為治療腦動(dòng)脈栓塞提供了新的治療手段。BMSCs來(lái)源充足，生物特性穩(wěn)定，易于傳代培養(yǎng)，可以分泌大量促血管生長(zhǎng)因子[5]。BMSCs移植可以通過(guò)組織滲透、減少細(xì)胞凋亡、分泌細(xì)胞因子、減少炎癥反應(yīng)等許多途徑而作用于神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)受損組織發(fā)揮修復(fù)與保護(hù)的作用[6]。BMSCs具有多向分化的功能，有研究表明BMSCs移植可以遷移到病變部位，分化為神經(jīng)細(xì)胞，改善腦梗死模型大鼠的神經(jīng)功能[7]。BMSCs移植對(duì)腦缺血損傷具有恢復(fù)、保護(hù)作用，其作用機(jī)理可能是通過(guò)增加神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量與神經(jīng)因子表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[8]。

血管新生是指血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成因子的作用下形成新生血管，血管發(fā)生密度改變決定了腦梗死后神經(jīng)元存活與否，同時(shí)也是干細(xì)胞移植成功與否的關(guān)鍵性因素[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)股靜脈注射將BMSCs移植到MCAO大鼠模型體內(nèi)，通過(guò)促進(jìn)栓塞區(qū)血管新生降低神經(jīng)功能的損失。本研究發(fā)現(xiàn)栓塞區(qū)腦組織血管新生明顯多于對(duì)照組，BMSCs組有大量微血管生成，提示可能是VEGF表達(dá)上調(diào)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，數(shù)量增加，在第14天時(shí)數(shù)量開始下降，進(jìn)一步Westernblot、PCR實(shí)驗(yàn)也證明了這一推論。

目前廣大學(xué)者認(rèn)為與血管新生密切有關(guān)的是VEGF和Notch信號(hào)通路。病理?xiàng)l件下，Notch信號(hào)通路與血管形成密切相關(guān)，而VEGF可以通過(guò)Notch信號(hào)通路發(fā)揮生理作用，促進(jìn)血管生成[10-11]。VEGF是特異性促血管生成因子，對(duì)血管新生的起始具有關(guān)鍵性作用，其中VEGF165的作用最明顯。MACO動(dòng)物模型顯示，MACO后24小時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞開始明顯增生[12]，在本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs移植到腦栓塞大鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)VEGF165蛋白、mRNA相較于假手術(shù)對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明BMSCs移植能夠通過(guò)增加VEGF165的表達(dá)從而促進(jìn)血管新生。

研究發(fā)現(xiàn)，許多信號(hào)通路參與了血管新生的過(guò)程，其中Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)作用尤為突出[13]，另外，Notch信號(hào)激活可以促進(jìn)BMSCs移植作用，使心肌梗死區(qū)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化,促進(jìn)缺血心肌中毛細(xì)血管新生[14],此外還對(duì)一些組織的血管生成具有調(diào)控作用[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs移植到腦栓塞大鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白、mRNA相較于假手術(shù)對(duì)照組明顯升高，表明BMSCs移植后可能通過(guò)激活Notch信號(hào)通路而促進(jìn)腦動(dòng)脈栓塞組織中VEGF165的表達(dá)，從而促進(jìn)形成新生的血管[2]。

組織器官缺血后VEGF和Notch信號(hào)通路均與血管新生有著密切關(guān)系。VEGF能刺激血管的新生，是血管生成的重要因素，VEGF表達(dá)增加激活Notch信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了腦栓塞組織區(qū)的VEGF165蛋白、mRNA與Notch1蛋白、mRNA，結(jié)果顯示，MCAO組、BMSCs組VEGF165蛋白、mRNA與Notch1蛋白、mRNA表達(dá)較假手術(shù)對(duì)照組明顯升高。表明Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)BMSCs分化，提示VEGF調(diào)控血管生成過(guò)程中，Notch信號(hào)通路也參與血管新生，起著重要調(diào)控作用。

綜上所述，BMSCs移植可對(duì)腦動(dòng)脈栓塞大鼠有很好的治療效果，能夠使BMSCs在栓塞區(qū)存活，加快促進(jìn)血管新生，提高VEGF、Notch表達(dá)，激活VEGF/Notch通路，促進(jìn)受損神經(jīng)功能的恢復(fù)，在一定程度上保護(hù)了腦組織，為臨床治療腦栓塞提供了新的治療方法。但VEGF/Notch通路在BMSCs移植促進(jìn)腦微血管形成中的具體機(jī)制需要廣大學(xué)者的進(jìn)一步探索。