硝化應(yīng)激參與同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬降低

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(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬 北京潞河醫(yī)院病理科；3.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一種含硫氨基酸，當(dāng)人體血漿Hcy水平高于10 μmol/L即被認(rèn)為是高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)[1]。高同型半胱氨酸血癥是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，參與并導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。血管內(nèi)皮功能障礙是許多心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)及始動(dòng)環(huán)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道，HHcy能夠通過炎癥[3]、氧化應(yīng)激[4]等機(jī)制導(dǎo)致嚴(yán)重的血管內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生。自噬是體內(nèi)高度保守的生物過程，對(duì)于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞正常功能具有十分重要的作用[5-6]。有研究表明，Hcy能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平[7]，但其機(jī)制并不十分清楚。在作者前期的研究中發(fā)現(xiàn)，HHcy能夠升高機(jī)體硝化應(yīng)激水平，產(chǎn)生大量的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite, ONOO-)等強(qiáng)氧化物質(zhì)，導(dǎo)致嚴(yán)重的血管內(nèi)皮損傷[8]。Hcy是否會(huì)通過升高硝化應(yīng)激水平導(dǎo)致細(xì)胞自噬損傷呢？本研究擬探究硝化應(yīng)激在Hcy降低血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用，為闡明HHcy導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑3月齡雄性SD大鼠均由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；大鼠血漿Hcy酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成，中國)；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)；Hcy試劑(Sigma-Aldrich公司，美國)；FeTMPyP試劑(Cayman Chemical公司，美國)；LC3抗體、p62抗體(CST，美國)、3-NT抗體(Millipore 公司，美國)；GAPDH抗體、山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記和山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(Santa Cruz公司，美國)；兔/小鼠超敏二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司；Western blot電泳儀，Western blot電轉(zhuǎn)儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2主要方法

1.2.1 HHcy大鼠模型構(gòu)建及血漿Hcy濃度的檢測

將SD大鼠隨機(jī)分為正常飲食喂養(yǎng)組及2.5%蛋氨酸飲食喂養(yǎng)組，在喂養(yǎng)6個(gè)月后，酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血漿Hcy濃度。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，置于95% O2和5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育。細(xì)胞貼壁后，隔天換液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%進(jìn)行傳代至6孔板繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)6孔板細(xì)胞密度達(dá)60%～70%，給予細(xì)胞2.5 μmol/L FeTMPyP預(yù)處理30 min后，給予細(xì)胞500 μmol/L Hcy處理24 h。加藥完成后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 將胸主動(dòng)脈石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，用PBS漂洗；微波爐法進(jìn)行組織抗原修復(fù)，當(dāng)切片恢復(fù)至室溫后，用5% BSA室溫封閉20 min，甩掉封閉液，分別加入LC3、p62及NT抗體，4 ℃孵育過夜；次日，取出切片恢復(fù)至室溫后，PBS沖洗，使用兔/小鼠超敏二步法檢測試劑盒，室溫孵育聚合物輔助劑、辣根酶標(biāo)記抗小鼠IgG聚合物各30 min。鏡下觀察DAB顯色液使切片顯色情況，蘇木精染液染色5 min使細(xì)胞核著色，使用1%鹽酸酒精脫去非特異性染色。梯度乙醇二甲苯脫水，樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 Western blot 取加藥后HUVECs細(xì)胞蛋白用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，并超聲離心。取蛋白上清檢測蛋白濃度。根據(jù)濃度配制10 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳以分離條帶，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%奶粉室溫封閉1 h后孵育一抗，4℃過夜。洗膜后孵育二抗，ECL發(fā)光試劑曝光，得到顯色條帶。ImageLab軟件分析條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HHcy大鼠模型建立成功和正常飲食喂養(yǎng)的大鼠相比，2.5%蛋氨酸飲食喂養(yǎng)6月組大鼠血漿Hcy濃度明顯增加，表明HHcy大鼠模型建立成功(圖1)。

圖1 大鼠血漿Hcy濃度與Normal組比較，**P<0.01

2.2 HHcy大鼠胸主動(dòng)脈自噬相關(guān)蛋白及硝化應(yīng)激相關(guān)蛋白的檢測對(duì)HHcy大鼠胸主動(dòng)脈切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HHcy大鼠中硝化應(yīng)激相關(guān)蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯變化。由于ONOO-在體內(nèi)的代謝途徑復(fù)雜，并且反應(yīng)十分迅速，因此很難直接測量體內(nèi)ONOO-的濃度。目前，使用NT的單克隆抗體檢測到硝基酪氨酸的存在，被公認(rèn)為是體內(nèi)ONOO-生成的印跡。結(jié)果顯示，和正常大鼠相比，HHcy大鼠胸主動(dòng)脈NT的表達(dá)明顯增加，且集中在內(nèi)膜，提示HHcy大鼠體內(nèi)硝化應(yīng)激水平呈明顯升高的狀態(tài)(圖2A)。同時(shí)，檢測自噬相關(guān)蛋白LC3發(fā)現(xiàn)，HHcy大鼠LC3表達(dá)有所降低，而作為自噬底物，p62的表達(dá)卻明顯升高(圖2B)。提示HHcy大鼠胸主動(dòng)脈自噬水平明顯降低。

圖2 HHcy大鼠胸主動(dòng)脈NT、LC3及p62免疫組化染色A：大鼠胸主動(dòng)脈NT的表達(dá)(20×)； B：大鼠胸主動(dòng)脈LC3、p62的表達(dá)(20×)

2.3 Hcy對(duì)HUVECs硝化應(yīng)激及自噬相關(guān)蛋白的影響為探究Hcy對(duì)HUVECs細(xì)胞自噬及硝化應(yīng)激水平的影響，給予HUVECs細(xì)胞Hcy刺激(500 μmol/L，24 h)，并提取細(xì)胞蛋白，檢測其濃度后進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，Hcy刺激的HUVECs細(xì)胞NT表達(dá)明顯增加(圖3A)，提示Hcy刺激誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞硝化應(yīng)激水平增加。而自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)明顯降低(圖3B)；自噬底物p62的表達(dá)明顯增加(圖3C)，以上結(jié)果提示Hcy刺激HUVECs細(xì)胞自噬水平降低。

2.4 FeTMPyP能夠逆轉(zhuǎn)Hcy誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞自噬降低為進(jìn)一步探究Hcy誘導(dǎo)的硝化應(yīng)激升高及自噬降低之間的關(guān)系，用ONOO-清除劑FeTMPyP對(duì)HUVECs細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，在預(yù)處理30 min后加入Hcy刺激24 h。Western blot結(jié)果顯示，和Hcy(-)FeTMPyP(-)細(xì)胞相比，Hcy(+)FeTMPyP(-)處理的細(xì)胞NT表達(dá)明顯增加，而FeTMPyP預(yù)處理的細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)NT表達(dá)的增加，幾乎降低至正常水平(圖4A)，這提示FeTMPyP能夠清除ONOO-，以降低細(xì)胞的硝化應(yīng)激水平。同時(shí)，F(xiàn)eTMPyP預(yù)處理能夠提高LC3表達(dá)(圖4B)，同時(shí)降低p62表達(dá)(圖4C)。這提示FeTMPyP能夠逆轉(zhuǎn)由Hcy引起的自噬水平降低。

圖3 Hcy對(duì)HUVECs細(xì)胞NT、LC3 Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達(dá)情況的影響A：Hcy刺激下HUVECs細(xì)胞NT的表達(dá)；B：Hcy刺激下HUVECs細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)； C：Hcy刺激HUVECs細(xì)胞p62的表達(dá)與Con組比較，**P<0.01

圖4 FeTMPyP處理對(duì)Hcy刺激HUVECs細(xì)胞NT、LC3 Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達(dá)情況的影響A：FeTMPyP處理對(duì)Hcy刺激HUVECs細(xì)胞NT表達(dá)的影響；B：FeTMPyP處理對(duì)Hcy刺激HUVECs細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的影響； C：FeTMPyP處理對(duì)Hcy刺激HUVECs細(xì)胞p62表達(dá)的影響與Con組比較，**P<0.01

3 討論

HHcy是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。目前對(duì)于HHcy促進(jìn)心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究尚不完全清楚。自噬作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守的細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，對(duì)于維持心腦血管功能的穩(wěn)定具有十分重要的意義[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，HHcy能夠影響不同細(xì)胞的自噬水平。在本文作者前期研究中發(fā)現(xiàn)，Hcy能夠通過激活mTOR通路降低乳鼠心肌細(xì)胞中的自噬水平[11]；也有文獻(xiàn)報(bào)道，HHcy能夠通過增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用過度提高神經(jīng)元自噬水平，導(dǎo)致腦缺血后細(xì)胞死亡的發(fā)生[12]。已有文獻(xiàn)表明，Hcy在低濃度時(shí)提高自噬水平，而高濃度的Hcy則抑制自噬水平[7]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)Hcy這一損傷因素存在時(shí)，細(xì)胞能夠代償性地提高自噬以抵抗損傷；高濃度Hcy的持續(xù)刺激造成累積的嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞處于失代償，進(jìn)一步促進(jìn)損傷的發(fā)生。有研究表明，HHcy可能通過mTOR通路影響自噬水平[11,13]，而關(guān)于HHcy如何影響血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的研究少之又少。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色法以及Western blot技術(shù)檢測了HHcy大鼠以及Hcy處理的HUVECs細(xì)胞中NT的表達(dá)水平，以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，分別在在體水平及離體水平驗(yàn)證硝化應(yīng)激及細(xì)胞自噬的變化。結(jié)果表明，無論是HHcy大鼠的胸主動(dòng)脈中還是Hcy處理細(xì)胞中NT的表達(dá)水平明顯增加，NT被公認(rèn)為是體內(nèi)ONOO-生成的印跡，能夠反映體內(nèi)ONOO-的濃度及硝化應(yīng)激的水平[14]。HHcy大鼠的胸主動(dòng)脈及Hcy處理細(xì)胞中硝化應(yīng)激水平明顯增加，而自噬水平被明顯抑制。為進(jìn)一步驗(yàn)證HHcy通過提高硝化應(yīng)激降低自噬水平，本文作者在給予細(xì)胞Hcy處理的基礎(chǔ)上，加入ONOO-的清除劑FeTMPyP預(yù)處理細(xì)胞，以降低硝化應(yīng)激水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)eTMPyP預(yù)處理組細(xì)胞能夠明顯降低NT的表達(dá)。更為重要的是，當(dāng)FeTMPyP降低硝化應(yīng)激水平后，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)了由Hcy引起的自噬降低。

綜上，本研究表明HHcy可能通過升高硝化應(yīng)激水平以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平，這可能是HHcy導(dǎo)致心腦血管疾病的重要機(jī)制之一。本研究完善了HHcy對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)控的可能機(jī)制，為防治HHcy導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。