KU004抑制人源乳腺癌BT474裸鼠異種移植模型腫瘤生長的作用

孫蘭 李家春 李瑛光 郭慶明王振中

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，死亡率較高，居全球惡性腫瘤死亡率第5位［1］。臨床上約30%的乳腺癌患者HER2呈陽性，這部分患者易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差［2-4］。研究表明HER2陽性型乳腺癌患者對三苯氧胺和細(xì)胞毒性化療藥物耐藥［5］，但蒽環(huán)類和紫杉類藥物療效較好。拉帕替尼是一種新型小分子酪氨酸激酶抑制劑，對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和HER2均有抑制作用［6-7］，常用于治療HER2陽性型乳腺癌患者［8］，但是針對HER家族的靶向酪氨酸激酶抑制劑易耐藥、單藥治療有效率低、價格昂貴，尤其是耐藥性，已成為乳腺癌分子靶向治療面臨的難題。KU004是在抗癌藥物拉帕替尼的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改造的新化合物，本研究以人源乳腺癌BT474細(xì)胞為受試細(xì)胞，建立體內(nèi)裸鼠皮下移植瘤模型，評價KU004抑制移植瘤的效果，以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

BALB/c 裸鼠 60 只，雌性，體重 18～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：0278539，許可證號：SCXK（京）2014-0004。動物實驗過程均符合動物倫理委員會相關(guān)法規(guī)。人源乳腺癌BT474細(xì)胞購自美國菌種保藏中心。KU004購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，羥丙基甲基纖維素購自天津愛勒易醫(yī)藥材料有限公司，胎牛血清購自上海玉博生物科技有限公司。

1.2 人源乳腺癌BT474裸鼠異種移植模型的建立

人源乳腺癌BT474細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常傳代培養(yǎng)，每周傳代2次，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)。腫瘤細(xì)胞接種前1 d，每只裸鼠左側(cè)肩胛部皮下植入雌激素片（17-estradiol），于次日在每只裸鼠右側(cè)前脅肋部皮下接種PBS重懸的人源乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞8×107個/mL（加等體積Matrigel基質(zhì)膠），共接種60只。

1.3 分組及處理

人源乳腺癌BT474細(xì)胞接種第17天測量每只裸鼠的腫瘤體積，選取腫瘤體積為100～160 mm3的40只裸鼠，根據(jù)腫瘤體積大小隨機(jī)分為以下5組，每組8只：模型組（0.5%羥丙基甲基纖維素溶液灌胃）、拉帕替尼組（80 mg/kg拉帕替尼灌胃）、KU004低劑量組（40 mg/kg KU004灌胃）、KU004中劑量組（80 mg/kg KU004灌胃）、KU004高劑量組（120 mg/kg KU004灌胃）。各劑量組受試藥物均用0.5%羥丙基甲基纖維素溶液按所需濃度配制，從腫瘤細(xì)胞接種第20天開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥21 d。

1.4 裸鼠腫瘤生長的測量

使用游標(biāo)卡尺分別于給藥前以及給藥后1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、17 d、21 d 測量腫瘤的長徑和短徑并稱量體重，于末次給藥后24 h脫頸處死裸鼠，剝離腫瘤并稱重。計算腫瘤體積（tumor volume，TV）、相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV）、相對腫瘤增殖率（T/C）及腫瘤抑制率（inhibition rate，IR），計算公式如下：TV=0.5×長徑×短徑2；RTV=TVt/TV0（TV0為分組給藥時測量的腫瘤體積，TVt為每次測量的腫瘤體積）；T/C=TRTV/CRTV×100%（TRTV為給藥物組 RTV 的均值，CRTV為模型組RTV的均值）；IR=（1-給藥物組的平均瘤重/模型組的平均瘤重）×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，腫瘤體積和腫瘤重量組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用Dunnett T3檢驗（以模型組為參照組）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況

至實驗結(jié)束，與模型組比較，拉帕替尼組、KU004高劑量組、KU004中劑量組、KU004低劑量組裸鼠飲食、活動、毛色無明顯變化，給藥期間均無死亡。

2.2 各組裸鼠給藥期間體重的變化

拉帕替尼組、KU004高劑量組、KU004中劑量組、KU004低劑量組裸鼠在實驗藥物劑量下耐受性良好，隨給藥時間延長各組裸鼠體重變化不大，與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 給藥期間各組裸鼠TV、RTV的變化

模型組裸鼠隨著給藥時間延長TV、RTV明顯增大，KU004高劑量組、KU004中劑量組裸鼠TV、RTV逐漸減小，各給藥組TV、RTV分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），拉帕替尼組與KU004中劑量組TV、RTV比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、表3。給藥期間，拉帕替尼組、KU004高劑量組、KU004中劑量組和KU004低劑量組的T/C均有不同程度減小，給藥后21 d T/C分別為15.6%、6.9%、11.4%和32.7%，見表4。

表1 給藥期間各組裸鼠體重變化（g）

表2 各組裸鼠給藥期間的TV（mm3）

表3 各組裸鼠給藥期間的RTV

表4 給藥期間各組裸鼠的T/C（%）

2.4 給藥期間各組裸鼠的腫瘤重量和腫瘤抑制率

末次給藥24 h后，脫頸處死裸鼠，拉帕替尼組、KU004高劑量組、KU004中劑量組、KU004低劑量組裸鼠腫瘤的IR分別為85.0%、95.0%、91.0%、67.0%，平均腫瘤重量分別為（0.18±0.02）g、（0.08±0.01）g、（0.04±0.01）g、（0.28±0.04）g，各組的平均腫瘤重量均明顯低于模型組的（0.85±0.06）g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤。有研究報道25%～30%的乳腺癌患者癌細(xì)胞HER2受體過表達(dá)，此類患者預(yù)后明顯較HER2低表達(dá)患者差［9-10］。HER2已成為乳腺癌分子靶向治療藥物研究的重要靶點［11-12］。目前以HER2為靶點的抗乳腺癌分子靶向治療藥物主要有單克隆抗體（曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）、酪氨酸激酶抑制劑（拉帕替尼、吉非替尼）、曲妥珠單克隆抗體-DM1、mTOR抑制劑等［13］。拉帕替尼主要用于治療HER2陽性的晚期乳腺癌，是繼曲妥珠單抗后的第二種乳腺癌分子靶向治療藥物，但其耐藥性已成為乳腺癌分子靶向治療面臨的瓶頸，探索新的更高效的抗癌藥物成為該領(lǐng)域?qū)W者重要的研究課題。

乳腺癌動物模型的建立對人類乳腺癌的預(yù)防、診斷、治療及機(jī)制研究有重要作用［14］。裸鼠因先天性缺乏胸腺，T細(xì)胞免疫功能接近于零，是進(jìn)行人乳腺癌細(xì)胞異位移植最常用的動物［13］。目前建立的乳腺癌動物模型主要有自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、基因工程及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型［15］。移植法是建立乳腺癌動物模型常用的方法，根據(jù)移植物來源不同可分為同種移植和異種移植［16］。人源乳腺癌BT474細(xì)胞為HER2高表達(dá)細(xì)胞系，本實驗采用該細(xì)胞以8×107個/mL接種于裸鼠皮下建立異種移植模型，實驗期間均無裸鼠死亡，且成瘤性較好，與文獻(xiàn)報道一致［17］。進(jìn)一步在人乳腺癌裸鼠皮下移植模型中驗證KU004的抗癌作用，發(fā)現(xiàn)在給藥的21 d中各組裸鼠均未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)，拉帕替尼組、KU004高劑量組、KU004中劑量組、KU004低劑量組裸鼠在實驗藥物劑量下耐受性良好，隨給藥時間延長各組裸鼠體重變化不大，但T/C均有不同程度減小，各給藥組裸鼠腫瘤體積、腫瘤重量與模型組比較均顯著減小，腫瘤抑制率分別為85.0%、95.0%、91.0%、67.0%，且在同劑量下KU004的藥效略高于拉帕替尼，提示KU004對人源乳腺癌BT474裸鼠異種移植模型腫瘤具有抑制作用，移植瘤增殖速度減慢，在實驗藥物劑量下裸鼠對KU004耐受較好，后續(xù)將繼續(xù)研究KU004對正常組織及其他乳腺癌細(xì)胞異種移植動物模型腫瘤的影響，以進(jìn)一步驗證KU004作用。