橄欖苦苷對(duì)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤抑瘤作用的研究

許玉黎，黃惠娟，謝樹(shù)紅，陳渙渙，田黎明，楊 帆，曾小娟

0 引 言

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，卵巢癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，因其起病隱匿，確診時(shí)多屬晚期，是目前婦科惡性腫瘤中預(yù)后最差的癌癥，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]。卵巢癌的常規(guī)治療為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以順鉑聯(lián)合紫杉醇的化療方案，但卵巢癌容易發(fā)生化療耐藥和復(fù)發(fā)，耐藥的產(chǎn)生極大地限制了其臨床療效。橄欖苦苷是富含于天然橄欖油或橄欖葉中的一種重要的苯酚類裂環(huán)烯醚萜苷，具有抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松[2]、抗乳腺癌[3]、抗前列腺癌[4]、減輕輻射性卵巢損傷[5]等作用，本課題前期體外實(shí)驗(yàn)已證明其能抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖，但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤的模型，探討橄欖苦苷在其體內(nèi)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科提供。4～6周齡BALB/C雌性裸鼠20只[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)]，體重18～25 g，SPF級(jí)，購(gòu)買(mǎi)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，每周更換2次消毒的裸鼠墊料、飼料、飲用水，籠具每周消毒2次，所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的物品均經(jīng)消毒處理，自由攝水和進(jìn)食，標(biāo)準(zhǔn)SPF飼料。

1.2藥物與主要試劑橄欖苦苷(Funakoshi，Tokyo Japan)，MCCOY’S5A培養(yǎng)基(美國(guó)sigma公司)、胎牛血清(美國(guó)gibco公司)、青霉素鏈霉素雙抗溶液(美國(guó)gibco公司)、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)gibco公司)、PBS緩沖液(美國(guó)Hyclone公司)、DMSO溶液(二甲基亞砜，南京凱基生物公司)、兔抗人Bcl-2單抗(proteintech)、兔抗人Bax單抗(proteintech)、Western blot超敏發(fā)光液(PPLYGEN)、二抗、Buffer。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清、1%雙抗溶液配制的MCCOY’S5A完全培養(yǎng)基將SKOV3卵巢癌細(xì)胞接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～5天傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞后，800 r/min離心5 min，棄上清液，PBS緩沖液重懸，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。

1.4卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立75%乙醇常規(guī)消毒裸鼠右后肢背部的皮膚后，取0.2 mL的卵巢癌SKOV3細(xì)胞懸液分別注射于20只裸鼠的右后肢背部皮下成瘤。注射結(jié)束后用夾緊針孔，防止細(xì)胞懸液滲漏。所有裸鼠均在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，每周更換3次消毒的裸鼠墊料、飼料、飲用水，籠具每周消毒3次，所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的物品均經(jīng)消毒處理。日照選擇：開(kāi)燈、熄燈各12 h。每天常規(guī)觀察裸鼠的活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、飲食、大小便等情況。接種結(jié)束約1個(gè)月后，20只裸鼠右后肢背部皮下皆出現(xiàn)粟粒樣質(zhì)硬結(jié)節(jié)，分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只裸鼠荷瘤瘤體直徑均值達(dá)8 mm左右，即荷瘤模型建立成功。

1.5分組及治療將20只裸鼠隨機(jī)分為2組，每組10只。橄欖苦苷組：50 mg/(kg·d)，按10 mL/kg腹腔內(nèi)注射；等滲鹽水組：按0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg腹腔內(nèi)注射。2組均隔天給藥1次，連續(xù)給藥8周。

1.6觀察指標(biāo)每天觀察荷瘤裸鼠的活動(dòng)情況、對(duì)外界刺激的反應(yīng)、飲食水及瘤體表面皮膚變化，每周稱取裸鼠體重1次并測(cè)量腫瘤體積1次，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。方法如下：常規(guī)乙醇消毒裸鼠右后肢背部皮膚后，清楚地暴露腫瘤，用游標(biāo)卡尺(精度為0.01 mm)測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑a和最短徑b，腫瘤體積=a×b2/2。用藥結(jié)束后3 d，處死所有裸鼠，消毒腫瘤部位后輕輕剝離下腫瘤組織，計(jì)算腫瘤的相對(duì)增殖率，公式為：

相對(duì)增殖率=T/C×100%

T為橄欖苦苷組移植瘤體積的平均值，C為等滲鹽水組移植瘤體積的平均值。若此數(shù)值小于1，則表明橄欖苦苷組的移植瘤體積較等滲鹽水組明顯縮小。將剝離下的腫瘤組織置于-80 ℃冰箱中保存。

1.7Westernblot法檢測(cè)腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)①蛋白提取。取適量腫瘤組織剪碎成勻漿，加入RIPA裂解液(含PMSF)裂解，然后在4 ℃下12 000 rpm離心15 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。②配膠。10%分離膠(tris pH8.8)，一板5 mL；5%濃縮膠(tris pH6.8)，一板2 mL。先分離膠后濃縮膠。③電泳。樣品準(zhǔn)備：蛋白+Buffer混勻，100 ℃煮沸3 min，取出至室溫。將玻璃板及膠取下，裝入電泳槽，拔梳上樣，跑至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。④轉(zhuǎn)膜。準(zhǔn)備好PVDF膜(硝酸纖維素膜)，負(fù)：黑，海綿，濾紙，膠，膜，濾紙，海綿，白：正。放入轉(zhuǎn)膜槽中，電流150 mA，1.5 h。⑤封閉。膜放TBST配制的5%牛奶(脫脂奶粉)封閉，室溫下放搖床1 h。⑥加抗體：一抗Bcl-2配制比：1∶1000，1 uLAb+1 mL5%牛奶，一抗Bax配制比：1∶2000，1 uLAb+2 mL5%牛奶。取出膜放TBST過(guò)一下，放封口膜，加一抗大約2 mL，封口。放4 ℃搖床搖過(guò)夜(130轉(zhuǎn)左右)。取出膜，用TBST洗3次，每次10 min。制備二抗1∶5000，用5%牛奶配制，加二抗，室溫下?lián)u床1 h。倒掉二抗取出膜，TBST洗10 min，3次。⑦顯影。準(zhǔn)備好顯影液、定影液、水，放暗房。配制發(fā)光底物：A+B：1∶1(配完后避光)。準(zhǔn)備暗盒，鋪上保鮮膜。膜放保鮮膜上，滴加發(fā)光底物反應(yīng)3 min。蓋上保鮮膜，不要有氣泡，用粘紙黏上。移至暗房，放上膠片，曝光4 min，膠片放顯影液2 min，定影液1 min，烘干，將膠片進(jìn)行掃描，用圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間治療前后體重、瘤體積變化采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1裸鼠一般情況觀察2組裸鼠在卵巢癌移植瘤模型建立后約1個(gè)月，對(duì)外界刺激反應(yīng)尚可，進(jìn)食量無(wú)明顯變化，可出現(xiàn)行動(dòng)遲緩。所有裸鼠移植瘤的表面皮膚未見(jiàn)明顯破潰化膿等，20只裸鼠皮下移植瘤均有瘤體長(zhǎng)出，成瘤率100%，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)裸鼠死亡。

2.2裸鼠體重的比較注射藥物后2組裸鼠的體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

組別n21 d35 d56 d橄欖苦苷組1022.70±1.3323.50±1.0823.80±0.78等滲鹽水組1022.80±2.3423.90±1.6622.80±1.81

2.3裸鼠移植瘤的體積變化2組裸鼠的移植瘤體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。2組的移植瘤體積均呈遞增趨勢(shì)，橄欖苦苷組移植瘤生長(zhǎng)速度較等滲鹽水組明顯減緩，見(jiàn)圖1。肉眼觀察完整剝離下的腫瘤組織，淡紅色，呈球狀或橢圓狀，表面尚光滑，將組織剖開(kāi)可見(jiàn)呈魚(yú)肉狀，內(nèi)有多發(fā)質(zhì)硬乳頭狀結(jié)節(jié)。

組別n21d35d56d橄欖苦苷組100.37±0.08*0.40±0.08*0.43±0.06*等滲鹽水組100.48±0.040.59±0.040.69±0.06與等滲鹽水組比較,*P<0.05

圖1 裸鼠移植瘤體積的生長(zhǎng)曲線

2.4裸鼠移植瘤的相對(duì)增殖率計(jì)算出移植瘤的相對(duì)增殖率為70.3%，結(jié)果表明與等滲鹽水組比較，橄欖苦苷組的移植瘤體積明顯縮小。

2.5Westernblot法檢測(cè)腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)與等滲鹽水組比較，橄欖苦苷組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)上調(diào)。見(jiàn)圖2。

1: 橄欖苦苷組;2:等滲鹽水組圖2 裸鼠移植瘤WB條帶灰度分析圖

3 討 論

橄欖苦苷是一種無(wú)毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，裂環(huán)烯醚萜是環(huán)戊單萜衍生物中的一類化合物，是由環(huán)烯醚萜類化合物裂環(huán)而成，只占環(huán)烯醚萜類的很少一部分[6]，為橄欖葉中的有效成分。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的不斷深入挖掘，橄欖苦苷的藥理活性可體現(xiàn)在對(duì)心腦肝腎等器官的保護(hù)作用、降壓降糖、抗腫瘤等方面，其中尚未報(bào)道橄欖苦苷抗卵巢癌的作用機(jī)制。本課題前期體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)橄欖苦苷可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的的增殖，并且抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。

Hamdi等[7]發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷是一種有效的抗癌化合物，能直接破壞細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白微絲，抑制腫瘤細(xì)胞株的增殖和遷移，橄欖苦苷能不可逆的包圍癌細(xì)胞，阻止其復(fù)制、運(yùn)動(dòng)和侵襲，而這些在正常細(xì)胞中是可逆的。Giner等[8]通過(guò)橄欖苦苷干預(yù)小鼠腸炎型結(jié)直腸癌模型的研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷可抑制結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)，機(jī)制可能與降低腸道相關(guān)IL-6、干擾素γ，TNF-α、IL-17A以及COX-2、Bax蛋白和增殖細(xì)胞核抗原蛋白的表達(dá)，下調(diào)NF-KB、Wnt/β、PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的表達(dá)。Bulotta等[9]研究也證實(shí)，橄欖苦苷抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。Kimura等[10]研究橄欖苦苷對(duì)長(zhǎng)期紫外線照射下裸鼠皮膚腫瘤體積的影響，發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷能顯著抑制皮膚癌變和腫瘤的生長(zhǎng)，可能與阻止血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-13及COX-2的表達(dá)有關(guān)。

卵巢癌是一種多基因、多階段作用的疾病，癌基因的激活和抑癌基因的失活在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展和治療預(yù)后中起重要作用[11]。Bcl-2和Bax是兩類典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，Bax和Bcl-2通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bc1-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能。王穎欣等[12]實(shí)驗(yàn)研究顯示，Bcl-2蛋白和Bax蛋白在正常卵巢組織中均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，而B(niǎo)cl-2蛋白和Bax蛋白在卵巢癌組織中有較高水平表達(dá)。Hassan等[13]實(shí)驗(yàn)研究得出，橄欖苦苷誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制與p53調(diào)控Bax和Bcl-2基因表達(dá)的通路有關(guān)，是通過(guò)上調(diào)p53和Bax、下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，機(jī)制可能與其可顯著抑制Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，伴上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與p53基因的表達(dá)關(guān)系不大。

本研究通過(guò)建立起卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的模型，觀察橄欖苦苷對(duì)移植瘤體積生長(zhǎng)及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，橄欖苦苷組裸鼠移植瘤體積明顯小于等滲鹽水組，與等滲鹽水組比較，橄欖苦苷組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)上調(diào)。由此可得，橄欖苦苷對(duì)卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)有抑制作用，機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制卵巢癌SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，正常卵巢組與卵巢瘤組比較，PI3K mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯增高，這表明在卵巢漿液性囊腺癌中PI3K基因表達(dá)增強(qiáng)。近年來(lái)，PI3K/Akt信號(hào)通路在許多癌癥中過(guò)度表達(dá)，抑制此途徑被認(rèn)為是癌癥治療的重要靶點(diǎn)[16]。綜上，我們推測(cè)橄欖苦苷抗卵巢癌的機(jī)制可能也與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

近年來(lái)，橄欖苦苷的藥理活性備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，但其抗腫瘤的作用仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，且針對(duì)橄欖苦苷的藥理活性及毒理學(xué)研究有限，因此還需要更多的深入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明橄欖苦苷的抗腫瘤作用及安全性。橄欖苦苷作為一種無(wú)毒的天然藥物，它可能成為具有潛在應(yīng)用前景的輔助抗卵巢癌新藥，其抗卵巢癌的作用機(jī)制和臨床療效尚有待進(jìn)一步探究。