姜琳瑞,王小燕,張群,張書勤,楊靜,王紅,胡華鐘
膿毒癥(sepsis)是由感染引起的病原體與宿主免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用及其伴隨的全身炎癥狀態(tài)[1],其特征為感染反應(yīng)失調(diào)所致的危及生命的器官功能障礙[2]。免疫反應(yīng)作用對(duì)于抗感染至關(guān)重要,同時(shí)也是炎癥組織浸潤(rùn)和器官嚴(yán)重?fù)p傷的主要原因[3-4]。調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子有助于抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞,減輕全身炎癥反應(yīng),并緩解內(nèi)毒素造成的組織損傷[5]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的能力[6],有潛在的抗炎特性,可用于治療炎癥和組織損傷相關(guān)的疾病[7-8]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)具有高自我更新、高分化潛能、低免疫原性和調(diào)節(jié)免疫的特點(diǎn),來源廣泛,便于取材,可大規(guī)模獲取、培養(yǎng),且無倫理限制[9],在細(xì)胞移植治療方面優(yōu)于其他來源的MSCs,有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究采用hUCMSCs進(jìn)行膿毒癥小鼠的細(xì)胞移植治療,探討hUCMSCs對(duì)細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的膿毒癥模型炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,以及對(duì)受損器官的保護(hù)作用,以期為探索hUCMSCs治療膿毒癥的機(jī)制提供依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 6~8周齡C57BL/6小鼠,體重25~30g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,自由進(jìn)食、飲水,常溫環(huán)境飼養(yǎng)。白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司;IL-10多克隆抗體、TNF-α多克隆抗體購自美國ABclonal公司;LPS(大腸埃希菌O111:B4提取物)購自美國Sigma公司;Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。
1.2 膿毒癥小鼠模型的建立 腹腔注射LPS建立膿毒癥小鼠模型。取80只C57BL/6小鼠,隨機(jī)均分為4組,分別于腹腔注射5、10、20mg/kg LPS及等劑量PBS。于0h、6h、12h、24h、2d、3d、4d、5d時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各組小鼠體溫并觀察其活動(dòng)狀態(tài),確定最佳建模條件。最終確定造模用LPS劑量為10mg/kg。
1.3 hUCMSCs的培養(yǎng)與鑒定 臍帶獲取自所在醫(yī)院正常新生兒,簽署知情同意書,且經(jīng)該醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。取臍帶華通氏膠基質(zhì),剪碎為2.0mm3的組織塊,加入終濃度為0.05%的膠原酶Ⅱ,于37℃恒溫振蕩器中消化0.5h;消化完成后,加入PBS稀釋并過濾;濾液離心,用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸,以1×106/cm2接種于T-25cm培養(yǎng)瓶中;3d后全量換液;待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%~90%時(shí),用0.25%胰酶消化處理,按1:3比例傳代。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)所得細(xì)胞表面標(biāo)志(CD105、CD90、CD73/CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR)及成骨(茜素紅染色)和成脂(油紅O染色)誘導(dǎo)分化鑒定。按照國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出的陽性標(biāo)志物表達(dá)率≥95%、陰性標(biāo)志物≤2%的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒定。選取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.4 分組及樣本采集 另取C57BL/6小鼠29只,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)、LPS組(n=12)和hUCMSCs組(n=12)。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.5ml,1h后尾靜脈注射PBS 0.5ml;LPS組腹腔注射LPS 10mg/kg,1h后尾靜脈注射PBS 0.5ml;hUCMSCs組腹腔注射LPS 10mg/kg,1h后尾靜脈注射2.5×105個(gè)hUCMSCs。分別在給予細(xì)胞治療后3、6、12、24h采用5%水合氯醛麻醉小鼠,心臟采血,取血清保存于–80℃。迅速開胸、開腹摘取肝臟、腎臟和肺組織,置于4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)中固定,制成石蠟切片。
1.5 病理形態(tài)觀察 細(xì)胞治療后6h,進(jìn)行肺、腎、肝組織切片并行HE染色,觀察病理形態(tài)學(xué)變化。
1.6 炎癥因子表達(dá)水平測(cè)定 對(duì)以上各時(shí)間點(diǎn)肝組織切片進(jìn)行IL-10、TNF-α免疫組化檢測(cè),應(yīng)用Image J軟件分析肝組織炎癥因子表達(dá)情況。采用ELISA法測(cè)定血清TNF-α和IL-10水平,按照試劑盒說明書操作,根據(jù)450nm處吸光度(OD)值計(jì)算炎癥因子血清濃度。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和構(gòu)圖。計(jì)量資料用±s表示,驗(yàn)證方差齊性。多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA);兩個(gè)獨(dú)立樣本的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 hUCMSCs的培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡下可見細(xì)胞大小均一,折光性強(qiáng),貼壁率高,呈長(zhǎng)梭形漩渦狀排列,生長(zhǎng)特征穩(wěn)定,符合MSCs特性(圖1A)。MSCs的陽性表面標(biāo)志物(CD73、CD105、CD90)和陰性表面標(biāo)志物(CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR)檢測(cè)結(jié)果見圖1B。hUCMSCs經(jīng)成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后,油紅O染色鑒定結(jié)果如圖1C所示,與未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞比較,誘導(dǎo)后的hUCMSCs染色后出現(xiàn)大小不一的小脂滴,表明hUCMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可形成脂肪細(xì)胞,具有成脂分化潛能。hUCMSCs經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后,茜素紅染色鑒定結(jié)果如圖1D所示,與未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞比較,誘導(dǎo)后的細(xì)胞可形成鈣結(jié)節(jié),被茜素紅染成深紅色,表明hUCMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可形成成骨細(xì)胞,具有成骨分化潛能。上述結(jié)果均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定要求。
圖1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs)
2.2 hUCMSCs對(duì)膿毒癥小鼠肺、肝、腎病理結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠肝臟、腎臟、肺組織未見明顯異常改變。LPS組小鼠肺部有肺泡毛細(xì)血管充血、肺泡腔炎性細(xì)胞滲出浸潤(rùn)和肺泡壁增厚,肺泡間隔變粗,纖維增生;肝組織肝索紊亂,肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,大量炎癥細(xì)胞聚集在門脈區(qū)和肝竇內(nèi),可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞空泡變性等異常改變;腎臟有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,球囊間隙變窄,腎小管上皮細(xì)胞有水腫。hUCMSCs組小鼠上述癥狀均得到有效緩解,提示hUCMSCs對(duì)膿毒癥小鼠的多器官損傷有保護(hù)作用(圖2)。
2.3 hUCMSCs對(duì)膿毒癥小鼠肝組織炎癥因子分泌的影響 與對(duì)照組比較,LPS組各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織促炎因子TNF-α表達(dá)明顯升高,經(jīng)hUCMSCs治療后TNF-α表達(dá)與LPS組比較明顯降低(P<0.05,圖3)。與對(duì)照組比較,LPS組肝組織抗炎因子IL-10表達(dá)在3h達(dá)峰值,此后逐漸降低,但6h時(shí)仍明顯高于對(duì)照組,而12、24h時(shí)明顯低于對(duì)照組;經(jīng)hUCMSCs治療后IL-10表達(dá)與LPS組比較明顯升高(P<0.05,圖4)。
2.4 hUCMSCs對(duì)膿毒癥小鼠外周血清炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組比較,LPS組小鼠血清TNF-α有上升趨勢(shì),于12h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血清IL-10也存在上升趨勢(shì),且于6、12、24h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)hUCMSCs治療后3、6、12、24h,TNF-α水平均下降,但與同時(shí)間點(diǎn)LPS比較,僅24h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。hUCMSCs組IL-10水平在治療后各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組,且在3、6、12h明顯高于LPS組(P<0.05,表1)。
圖2 小鼠肺、腎、肝組織的病理學(xué)改變(HE ×200)Fig.2 Pathological changes of lung, kidney and liver in mice (HE ×200)Bar=5μm
圖3 小鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)的免疫組化分析Fig.3 Immunohistochemical analysis of TNF-α expression in liver tissue of mice
圖4 小鼠肝臟組織IL-10表達(dá)的免疫組化分析Fig.4 Immunohistochemical analysis of IL-10 expression in liver tissue of mice
表1 小鼠血清IL-10、TNF-α水平的變化(pg/ml,±s,n=3)Tab.1 Changes of IL-10 and TNF-α levels in serum of mice(pg/ml, ±s, n=3)
表1 小鼠血清IL-10、TNF-α水平的變化(pg/ml,±s,n=3)Tab.1 Changes of IL-10 and TNF-α levels in serum of mice(pg/ml, ±s, n=3)
(1)P<0.05 compared with control group, (2)P<0.05 compared with LPS group
Group TNF-α IL-10 Control 88.183±4.359 60.344±27.057 LPS 3h 89.806±27.775 1026.821±300.728 6h 83.404±26.694 2103.175±131.424(1)12h 104.534±17.336(1) 310.745±16.234(1)24h 78.300±4.338 655.099±53.343(1)hUCMSCs 3h 75.340±9.687(1) 2805.620±300.728(1)(2)6h 67.511±8.668(1) 602.620±2.319(1)(2)12h 62.675±2.136(1) 465.411±14.213(1)(2)24h 88.183±4.359(1)(2) 293.763±21.646(1)
膿毒癥的特點(diǎn)是感染引起全身炎癥狀態(tài),巨噬細(xì)胞被激活,釋放大量的促炎細(xì)胞因子,如TNF-α和IL-1β,內(nèi)源性促炎細(xì)胞因子過度活躍且促炎和抗炎細(xì)胞因子失衡,伴隨凝血途徑的廣泛激活,導(dǎo)致多器官衰竭、循環(huán)系統(tǒng)崩潰甚至死亡[10-11]。多器官功能衰竭是膿毒癥患者最主要的死亡原因,而肝、腎、肺組織是膿毒癥早期最常見的受損器官[12-13]。因此,針對(duì)性治療器官衰竭和炎癥因子紊亂是糾正膿毒癥的關(guān)鍵。
有研究表明,MSCs可調(diào)節(jié)血液中促炎/抗炎因子的水平,從而改善局部和全身炎癥反應(yīng),提高膿毒血癥小鼠的生存率[14]。不同來源的MSCs可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的嚙齒類動(dòng)物的肺臟損傷,主要通過抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子發(fā)揮治療作用,同時(shí),MSCs可以遷移至肺部受損組織,并在受損部位分化為肺細(xì)胞表型[15-17]。研究發(fā)現(xiàn),骨髓MSCs可促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子,如IL-10和TGF-1等,從而影響免疫細(xì)胞的分化、成熟和功能。而IL-10是公認(rèn)的抗炎細(xì)胞因子,且已被證明在保護(hù)身體免受炎癥過度傷害方面發(fā)揮重要作用[18]。
與其他來源的MSCs相比,hUCMSCs不僅具有較高的自我更新能力和較低的免疫原性,還可通過非侵入性程序獲得,且易于培養(yǎng),這使其在細(xì)胞移植治療方面優(yōu)于其他來源的MSCs。本研究表明,靜脈注射hUCMSCs可以減輕膿毒癥小鼠的肝、腎、肺組織損傷,調(diào)節(jié)肝組織及外周血中抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α的表達(dá),從而起到一定的改善膿毒癥的作用。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致,提示hUCMSCs可有效糾正膿毒癥小鼠的免疫系統(tǒng)紊亂及減輕組織損傷,對(duì)膿毒癥具有一定的治療作用。
有研究認(rèn)為,骨髓MSCs在缺乏單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的小鼠中不再有效[19]。但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,hUCMSCs可對(duì)肝臟中促炎/抗炎因子起到明顯的調(diào)節(jié)作用,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵免疫細(xì)胞,它的激活可釋放大量的促炎細(xì)胞因子,如TNF-α和IL-1β,并且與侵襲后的炎癥反應(yīng)有關(guān),在全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用[18],因此hUCMSCs作用的發(fā)揮可能是基于與肝臟巨噬細(xì)胞的相互作用;而MSCs可通過與局部組織間的接觸和可溶性因子的旁分泌作用來保護(hù)組織[20]。hUCMSCs是通過自身遷移到達(dá)受損器官中分化而發(fā)揮作用,還是注入體內(nèi)后通過旁分泌作用發(fā)揮療效還需探究,其對(duì)膿毒癥的具體作用機(jī)制也尚未明確,均有待進(jìn)一步研究。