間充質(zhì)干細(xì)胞過表達(dá)miR-21對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

王清，陳小瑩，李欣然，汪慶如，付霞霏

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病呈年輕化趨勢；隨著腫瘤化療技術(shù)的不斷研發(fā)及廣泛應(yīng)用，惡性腫瘤患者的存活率不斷提高，但與此同時出現(xiàn)的化療性卵巢早衰成為了年輕惡性腫瘤患者必須面對的問題，同時也是臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點及難點[1-2]?；熜月殉苍缢ナ侵富熀箝]經(jīng)持續(xù)1年，排除妊娠，卵泡刺激素(FSH)≥30mU/ml者[3]，嚴(yán)重威脅著患者的生殖健康。目前尚無有效方法從根本上修復(fù)化療藥物損傷的卵巢結(jié)構(gòu)和功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因其具有多能性及易于分離培養(yǎng)、擴(kuò)增的特性，是干細(xì)胞治療領(lǐng)域最有潛能的種子細(xì)胞[4-5]。研究顯示BMMSCs可用于修復(fù)脊髓、心肌和皮膚損傷等[6-7]。本課題組前期研究結(jié)果顯示BMMSCs可抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，部分修復(fù)化療藥物損傷的卵巢結(jié)構(gòu)和功能，但移植后部分細(xì)胞凋亡，尚達(dá)不到完全修復(fù)的效果[8]。

微小核糖核酸(miRNAs)存在于真核生物體內(nèi)，為一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的堿基序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶mRNA的剪切或翻譯。miRNAs在機(jī)體一系列生理及病理過程如細(xì)胞增殖、凋亡、分化及病原體感染中發(fā)揮調(diào)控作用[9-11]。其中，miR-21是較早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的一種miRNAs分子。研究證實，miR-21在多種腫瘤如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，參與腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移。同時，miR-21在卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用[12]。但miR-21能否增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)化療性卵巢早衰的療效鮮見報道。本研究構(gòu)建miR-21慢病毒載體，轉(zhuǎn)染BMMSCs，獲得miR-21修飾的BMMSCs(miR-21-BMMSCs)，并在體外將miR-21-BMMSCs與化療藥物誘導(dǎo)凋亡的顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，探討B(tài)MMSCs過表達(dá)miR-21對顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性清潔級Wistar大鼠6只，體重180～200g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)條件：室溫(23±2)℃，濕度45%～55%，光照時間12h，自由攝水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5d。

1.2 大鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 大鼠麻醉后，無菌條件下取出脛骨和股骨，制備成單細(xì)胞懸液，小心加入預(yù)先準(zhǔn)備的含密度為1.083的Percoll分離液的離心管內(nèi)，注意勿使兩種液體混合，兩種液體體積比為1:1。以2500r/min離心20min，小心吸取中間界面乳白色的單個核細(xì)胞層，用PBS洗2次后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，按1×106/ml密度將細(xì)胞接種培養(yǎng)。實驗所用BMMSCs為第2～4代細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD34、CD44、CD45的表達(dá)，進(jìn)行表面標(biāo)志鑒定。

1.3 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 3～4周雌性Wistar大鼠皮下注射孕馬血清(PMSG)60U/只，48h后斷頸處死，取出卵巢。在解剖顯微鏡下用注射器針頭刺破其表面的成熟卵泡，使顆粒細(xì)胞釋放入培養(yǎng)液中，分離卵巢顆粒細(xì)胞。收集的細(xì)胞用PBS洗2次后加入適量培養(yǎng)液重懸培養(yǎng)24h后行HE染色。具體步驟：制備顆粒細(xì)胞爬片，經(jīng)甲醛固定后依次通過無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇脫水，進(jìn)行HE染色，再依次通過95%乙醇、無水乙醇，晾干后中性樹脂封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫組化法檢測卵泡刺激素受體(FSHR)蛋白表達(dá)：將顆粒細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后加入4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封閉30min后，滴加FSHR兔多克隆抗體(1:500)4℃孵育過夜，加入聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗室溫下孵育30min。DAB顯色5～10min，蘇木精復(fù)染3min，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，自來水沖洗1min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 LV-miR-21的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建miR-21慢病毒載體，慢病毒表達(dá)載體pLVX-shRNA2由Clontech公司提供(載體編號：VT1457)。以含有rno-miR-21-5p序列的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增片段用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離純化，并回收得到的目的片段。經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切后，再次純化得到rno-miR-21-5p片段。pLVX-shRNA2空載體用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切后，回收線性化空載體。將線性化載體與純化的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下置于16℃條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂在含氨芐青霉素的LB平板上，置于37℃條件下培養(yǎng)過夜。挑取少許菌落溶于LB培養(yǎng)液中，取1μl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行初步鑒定；培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。進(jìn)行慢病毒載體的包裝，測定滴度為1×109/ml。將攜帶miR-21基因的慢病毒液以感染復(fù)數(shù)(MOI)為20加入BMMSCs培養(yǎng)液中，感染24～48h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，計算感染效率。

1.5 miR-21的表達(dá)檢測 實驗分為3組：BMMSCs組(不轉(zhuǎn)染病毒液)、LV組(轉(zhuǎn)染空載病毒液)、miR-21組(miR-21慢病毒載體以MOI=20轉(zhuǎn)染BMMSCs)。采用實時熒光定量qRT-PCR方法檢測各組BMMSCs中miR-21的表達(dá)水平。實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，按RNA提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA。取2ng細(xì)胞總RNA作為起始模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10μl，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.6 BMMSCs過表達(dá)miR-21對顆粒細(xì)胞凋亡的影響 實驗分為5組：正常組、磷酰胺氮芥(PM)組、miR-21組、BMMSCs組、miR-21-BMMSCs組。正常組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中不加PM，PM組加入30μmol/L的PM誘導(dǎo)凋亡，miR-21組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中加PM誘導(dǎo)凋亡后轉(zhuǎn)染LV-miR-21，BMMSCs組、miR-21-BMMSCs組顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PM 24h后分別與BMMSCs、miR-21-BMMSCs以1:1比例共培養(yǎng)，48h后采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況，采用qRT-PCR法檢測miR-21、程序性死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome Ten，PTEN)mRNA的表達(dá)量，Western blotting檢測PTEN、PDCD4蛋白表達(dá)水平。

1.7 實時定量PCR(RT-PCR)檢測miR-21、PTEN和PDCD4 mRNA表達(dá)水平 RT-PCR反應(yīng)條件為95℃10min；95℃預(yù)變性10s、60℃退火60s，共40個循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件為：95℃ 15s、65℃ 60min、95℃ 30s。2–ΔΔCt法分析實時定量PCR的結(jié)果。miR-21、PTEN和PDCD4定量分別采用miRNA U6、GAPDH為內(nèi)參照。實驗重復(fù)3次。引物序列：miR-21上游為5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTG-3'，下游為5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'；PTEN上游為5'-CCCAGTTTGTGGTCTGCCAGC-3'，下游為5'-ATGAGCTTGTC-CTCCCGCCG-3'；PDCD4上游為5'-TTGAGCACGGAGAT-ACGAAC-3'，下游為5'-GTCCCGCAAAGGTCAGAAAG-3'。

1.8 Western blotting檢測PTEN、PDCD4蛋白表達(dá)水平 使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，分離蛋白；將PVDF膜封閉后加入用Western一抗稀釋液稀釋的兔抗人PDCD4(1:1000)、兔抗人PTEN(1:1000)，4℃環(huán)境下雜交過夜；加二抗雜交溶液雜交26min。采用柯達(dá)凝膠成像儀行發(fā)光檢測，結(jié)果以PTEN、PDCD4帶與內(nèi)參照β-actin條帶光密度(OD)值的比值表示。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs的培養(yǎng)及鑒定 第3代BMMSCs細(xì)胞形態(tài)均一，為成纖維細(xì)胞樣的長梭形，排列有序(圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明90%以上細(xì)胞CD34和CD45為陰性，CD44和CD29為陽性，證實為BMMSCs。

2.2 構(gòu)建miR-21慢病毒載體 使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ及BamH Ⅰ雙酶切，T4DNA連接酶連接，將miR-21插入pLVX-shRNA2，構(gòu)建LV-miR-21重組質(zhì)粒。陽性克隆的測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中插入的rno-miR-21-5p序列與目標(biāo)序列完全一致，證實成功構(gòu)建了miR-21慢病毒載體系統(tǒng)。攜帶miR-21基因的慢病毒液以MOI=20感染BMMSCs后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)(圖1B)，轉(zhuǎn)染效率為92.20%±1.96%。

圖1 BMMSCs的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Fig.1 Cultivation in vitro and transfection of BMMSCs

2.3 BMMSCs轉(zhuǎn)染載體后miR-21的表達(dá) RTPCR檢測結(jié)果顯示，BMMSCs組、LV組、miR-21組miR-21的表達(dá)量(分別為1.0154±0.0258，1.0191±0.0500，4.2410±0.4367)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=268.032，P=0.000)，其中miR-21組明顯高于BMMSCs組及LV組，但BMMSCs組與LV組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

2.4 大鼠卵巢原代顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 大鼠卵巢原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)2～3d可完全貼壁，呈單層貼壁集落樣生長，胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)(圖3A)；HE染色后，顯微鏡下觀察可見顆粒細(xì)胞形態(tài)呈多角形或短梭形，細(xì)胞核大而圓、深染，胞質(zhì)富含顆粒及空泡，呈淡紅色(圖3B)；此外FSHR免疫組化檢測結(jié)果顯示，＞95%的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕色目的蛋白表達(dá)，藍(lán)紫色的為細(xì)胞核(圖3C)。

2.5 BMMSCs過表達(dá)miR-21對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，正常組、PM組、miR-21組、BMMSCs組、miR-21-BMMSCs組的細(xì)胞凋亡率分別為10.4%±1.8%、33.4%±4.2%、27.0%±2.5%、28.0%±2.0%、19.6%±1.5%，5組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.35，P=0.00)，其中miR-21-BMMSCs組細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-21組、BMMSCs組，但仍高于正常組。

圖2 BMMSCs轉(zhuǎn)染載體后miR-21的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-21 in BMMSCs transfected with LV-miR-21

2.6 顆粒細(xì)胞miR-21及PTEN、PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá) miR-21組、miR-21-BMMSCs組miR-21的表達(dá)水平明顯高于其他各組，PTEN、PDCD4的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于PM組、BMMSCs組(圖4)。

圖3 卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定Fig.3 Cultivation in vitro and identification of granulose cells

圖4 各組顆粒細(xì)胞的凋亡情況及miR-21、PTEN、PDCD4 mRNA和蛋白表達(dá)情況Fig.4 Apoptosis of granulose cells and mRNA and protein expression of miR-21, PTEN and PDCD4

3 討 論

近年來，全球惡性腫瘤發(fā)病率不斷上升，且呈低齡化的趨勢。化療廣泛用于惡性腫瘤的治療，使患者的生存率得到明顯提高，但化療性卵巢早衰嚴(yán)重影響著化療后女性的生活質(zhì)量[13]。美國加利福尼亞州癌癥中心的統(tǒng)計結(jié)果表明，在接受化療的育齡期乳腺癌女性患者中，卵巢早衰的發(fā)病率為55%[14]。卵巢既是生育器官，同時也是重要的內(nèi)分泌器官，對體內(nèi)外因素非常敏感，易受到各種理化因素的損害。目前認(rèn)為，化療藥物主要影響卵泡的生長、發(fā)育和成熟，導(dǎo)致卵泡閉鎖和卵巢組織纖維化，以及顆粒細(xì)胞的凋亡。已有的體內(nèi)外化療藥物毒性實驗中均檢測到卵巢顆粒細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生。顆粒細(xì)胞是組成卵泡的最大細(xì)胞群，是雌、孕激素的主要來源，對維持卵泡正常的結(jié)構(gòu)和功能起著舉足輕重的作用，顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡的閉鎖密切相關(guān)。因此，抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡和卵泡閉鎖，就有可能延緩或避免卵巢早衰的發(fā)生。目前治療卵巢早衰的方法包括激素治療、促性腺激素釋放激素激動劑治療、卵子胚胎冷凍、卵巢組織冷凍移植等，但這些治療方法的效果均欠佳[15]。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新及分化為多種細(xì)胞的能力，可以修復(fù)受損的器官結(jié)構(gòu)及其功能，從而為化療誘導(dǎo)的卵巢功能早衰提供替代治療。BMMSCs移植可用于治療多種損傷性疾病，如心肌、腦、脊髓、皮膚及頜面部損傷等，已在多種疾病的動物模型中得到證實[6-7]，且已取得了滿意的臨床療效。本課題組前期研究將BMMSCs引入卵巢早衰的治療中，并通過體內(nèi)外實驗證實了BMMSCs對化療性卵巢早衰的修復(fù)作用，初步證實其修復(fù)作用與抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[8]，但治療效果不如預(yù)期，考慮移植后BMMSCs的迅速大量凋亡是導(dǎo)致治療效果不佳的主要因素。因此實施預(yù)處理提高移植細(xì)胞的存活率是提高療效的關(guān)鍵所在。

miR-21是一種較早在人體中發(fā)現(xiàn)且分布相對廣泛的miRNA，在細(xì)胞核內(nèi)通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄先形成pri-miR-21，再進(jìn)行修飾，進(jìn)一步形成成熟的miR-21。miR-21具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用，在多種腫瘤細(xì)胞及組織中都具有較高水平的表達(dá)[9]。miR-21對卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡及卵泡發(fā)育過程亦具有重要的調(diào)控作用。研究證實，miR-21可抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，增加排卵率[12]。近期研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-21的BMMSCs凋亡減少，存活力增強(qiáng)，其機(jī)制可能與下調(diào)靶基因PTEN的表達(dá)從而實現(xiàn)對PI3K/Akt通路的調(diào)控密切相關(guān)[16]。本實驗將miR-21-BMMSCs與化療藥物誘導(dǎo)凋亡的顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-21的BMMSCs具有更強(qiáng)的抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的能力。據(jù)報道，miR-21的靶基因約有190個，目前研究較為透徹的是PDCD4、PTEN，均在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮作用。PTEN通過調(diào)控下游PI3K途徑，對卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響。PTEN水平下調(diào)，磷酸化PIP-3則激活蛋白激酶B(Akt)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖以及抑制細(xì)胞凋亡[17]，如PTEN表達(dá)不平衡將導(dǎo)致卵巢功能衰竭[18]。PDCD4能結(jié)合真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(elF4e)，抑制其復(fù)合物的產(chǎn)生，從而在起始階段調(diào)節(jié)蛋白翻譯過程[19]。PDCD4參與脂多糖(LPS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在LPS信號通路中，Toll樣受體4(TLR4)上調(diào)可增加PDCD4表達(dá)，誘導(dǎo)下游IL-10以及NF-κB的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，PTEN及PDCD4在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，下調(diào)PTEN及PDCD4的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡。本研究檢測了miR-21相關(guān)靶基因PTEN、PDCD4 mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-21的BMMSCs中PTEN、PDCD4的表達(dá)降低，證實了miR-21可通過下調(diào)PTEN及PDCD4的表達(dá)抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

總之，本研究結(jié)果提示，BMMSCs過表達(dá)miR-21可明顯減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)靶基因PTEN、PDCD4的表達(dá)密切相關(guān)。