遼寧省大連市種公豬偽狂犬病血清抗體與精液病原的對(duì)應(yīng)檢測

陳明非，譚立文，李 巍，蒼真?zhèn)?，?帥，陳 林，許志國，王承功

（大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

豬偽狂犬病（PR）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，可感染各生長階段的豬，但感染后癥狀表現(xiàn)各異：仔豬主要表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率高；育肥豬和后備豬以呼吸道癥狀為主，生長停滯；生產(chǎn)母豬主要表現(xiàn)繁殖障礙；成年公豬一般不表現(xiàn)明顯癥狀，但精液中可持續(xù)帶毒12 d。該病的突出特點(diǎn)是耐過的急性感染豬可終身潛伏帶毒而不表現(xiàn)臨床癥狀，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，潛伏狀態(tài)下的PRV可被激活而引發(fā)再次感染并向外散毒[1]。這種潛伏帶毒的豬是豬場最危險(xiǎn)的傳染源，剔除此類豬對(duì)根除PR具有重要意義。目前豬場主要通過免疫PRV基因缺失苗，同時(shí)檢測豬血清中的PRV gE抗體，然后淘汰PRV gE抗體陽性豬，逐步凈化PR[2]。近年來，我國多個(gè)豬場發(fā)生的PR疫情均與種公豬精液帶毒有關(guān)[2-5]。為了解大連市種公豬精液中的PRV帶毒情況，采集種豬場的種公豬精液和對(duì)應(yīng)的血清樣品以及同場經(jīng)產(chǎn)母豬的血清樣品，同步進(jìn)行PRV免疫抗體、野毒感染抗體和病毒核酸檢測。

1 材料

1.1 樣品

對(duì)大連市24個(gè)種豬場的種公豬全部采樣，同場經(jīng)產(chǎn)母豬按10%比例采樣。共對(duì)108頭種公豬對(duì)應(yīng)采集精液和全血，對(duì)573頭經(jīng)產(chǎn)母豬采集全血。采集的精液包括原精液和經(jīng)稀釋16～18 ℃保存不超過3 d的精液，?70 ℃保存；從全血分離血清，4 ℃保存。

1.2 主要試劑

PRV gE抗體檢測試劑盒（批號(hào)為GN301）、PRV gB抗體檢測試劑盒（批號(hào)KN364）：美國IDEXX公司生產(chǎn)；PRV核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，批號(hào)20171130）：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)；DNA提取試劑盒（批號(hào)AK501）：寶生物工程（大連）公司提供；PR陽性病料：大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室確診并保存的死亡仔豬的腦組織。

1.3 主要儀器

全波長酶標(biāo)儀（型號(hào)Infinite M200）：瑞士TECAN公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀（型號(hào)QuantStudio5）：美國Thermo Fisher科技公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)3K-15）：德國SIGMA生司生產(chǎn)； 超低溫冰箱（型號(hào)Forma906-ULTS）：美國基因公司提供。

2 方法

2.1 種豬場PR免疫情況調(diào)查

對(duì)24個(gè)種豬場采用的PR疫苗種類，種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的PR免疫次數(shù)，以及豬群健康狀況進(jìn)行調(diào)查。

2.2 PRV gB、gE抗體檢測

對(duì)采集的血清樣品，用ELISA方法分別檢測PRV gB、gE抗體，按照1.2中的抗體檢測試劑盒說明書操作。通過計(jì)算每個(gè)樣品的S/N值，判定是否存在PRV gB、gE抗體，對(duì)于陽性和可疑的樣品，需要進(jìn)行重復(fù)檢測確認(rèn)。

2.3 種公豬精液PRV 核酸提取與檢測

將采集的精液樣品于?70～37 ℃反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心1 min；取上清液，按1.2中的DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA，延長Proteinase K的裂解時(shí)間至4 h；裂解過程在56 ℃水浴中進(jìn)行，水浴時(shí)常將樣品取出進(jìn)行振蕩，以加速裂解；將提取的DNA按1.2中PRV核酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)。在PRV核酸提取與檢測過程中，以生理鹽水作為全過程的陰性質(zhì)控，以已知PR陽性病料作為全過程的陽性質(zhì)控，以含目的片段的重組質(zhì)粒作為熒光PCR反應(yīng)體系的陽性質(zhì)控。在陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控結(jié)果滿足質(zhì)控要求的前提下，檢測樣品有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤38時(shí)判為PRV核酸陽性，Ct值＞38或無Ct值時(shí)，判為PRV核酸陰性。

2.4 種公豬場分級(jí)及經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體分析

根據(jù)種豬場種公豬的PRV gB、gE抗體及精液病原檢測結(jié)果，由高到低劃分出不同PR凈化等級(jí)的種公豬場，然后分析不同等級(jí)種公豬場經(jīng)產(chǎn)母豬的PRV gE抗體。

3 結(jié)果與分析

3.1 種豬場PR免疫情況

這些種豬場的種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬均進(jìn)行過2～4次不等的PRV基因缺失活疫苗免疫，其中23個(gè)場用的是Bartha-K61株活疫苗，1個(gè)場用的是HB-98株活疫苗。目前多數(shù)豬場的母豬生產(chǎn)情況穩(wěn)定，個(gè)別場有母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎情況發(fā)生。

3.2 血清抗體檢測

3.2.1 PRV gB抗體 24個(gè)種豬場的108份種公豬血清樣品中，檢出PRV gB抗體陽性樣品77份，陽性率為71.3%；573份經(jīng)產(chǎn)母豬血清樣品中，檢出PRV gB抗體陽性樣品445份，陽性率為77.7%。種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gB抗體陽性率總體差異不大。

3.2.2 PRV gE抗體 24個(gè)種豬場的108份種公豬血清樣品中，檢出PRV gE抗體陽性樣品40份，陽性率為37.0%，其中15個(gè)場的陽性率為0，4個(gè)場的陽性率為100%。573份經(jīng)產(chǎn)母豬血清樣品中，檢出PRV gE抗體陽性樣品216份，陽性率為37.7%。種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體總體陽性率非常接近。

3.3 精液PRV 核酸檢測

108份精液樣品中，檢出PRV核酸陽性樣品3份，其對(duì)應(yīng)的血清樣品PRV gE抗體檢測均為陰性。

3.4 種公豬場分級(jí)及經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體比較

根據(jù)種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬檢測結(jié)果（表1），劃分為四級(jí)種公豬場。一級(jí)種公豬場：種公豬PRV gE抗體陽性率為0，gB抗體陽性率為100%，精液PRV核酸檢測全部為陰性，共計(jì)6個(gè)場，占比25%；二級(jí)種公豬場：種公豬PRV gE抗體陽性率為0，PRV gB抗體陽性率為0～100%，共計(jì)9個(gè)場，其中1個(gè)場檢出PRV核酸陽性精液樣品；三級(jí)種公豬場：PRV gE抗體陽性率為0～100%，PRV gB抗體陽性率≤100%，共計(jì)5個(gè)場，其中2個(gè)場檢出PRV核酸陽性精液樣品；四級(jí)種公豬場：種公豬PRV gE抗體、gB抗體陽性率均為100%，精液PRV核酸檢測全部為陰性，共計(jì)4個(gè)場。

各級(jí)種公豬場經(jīng)產(chǎn)母豬的平均PRV gE抗體陽性率分別為：一級(jí)場0、二級(jí)場18.8%、三級(jí)場77.5%、四級(jí)場87.8%?？梢姺N公豬與經(jīng)產(chǎn)母豬的PRV野毒感染密切相關(guān)，野毒感染在經(jīng)產(chǎn)母豬群中呈現(xiàn)放大趨勢，二、三、四級(jí)種公豬場因種公豬導(dǎo)致PR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)在逐級(jí)加大。

表1 種公豬場分級(jí)及種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬檢測結(jié)果

4 討論

4.1 帶毒種公豬對(duì)豬場PRV感染的放大作用

PRV gB抗體檢測是對(duì)PRV全病毒抗體的檢測，主要用于評(píng)估PR免疫情況，而PRV gE抗體檢測主要是為了監(jiān)測PRV野毒感染。通常情況下，兩種抗體的配合檢測能綜合評(píng)估豬場的野毒感染情況和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。在檢測大連市種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV兩種抗體的同時(shí)，對(duì)應(yīng)檢測了種公豬精液中的PRV核酸。結(jié)果顯示，種公豬PRV gB抗體陽性率為71.3%，gE抗體陽性率為37.0%，精液PRV核酸陽性率為2.8%，表明種公豬PR總體免疫效果一般，野毒感染情況比較嚴(yán)重。但其中25%種豬場（劃分為一級(jí)種公豬場）的種公豬PRV凈化狀況很好，PRV gE抗體陽性率為0，gB抗體陽性率為100%，精液PRV核酸檢測為陰性，而且這些種豬場抽檢的經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體全部為陰性。而二、三、四級(jí)種公豬場的種公豬均存在從低到高的PRV野毒感染率，經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體陽性率也明顯呈現(xiàn)從低到高的變化趨勢，可見種公豬在PRV傳播、擴(kuò)散中起到了關(guān)鍵性作用。帶毒種公豬通過精液將病毒傳染給母豬，感染母豬又可以將病毒垂直或水平傳播到商品豬群，帶毒商品豬則不斷擴(kuò)散病毒，因此一頭帶毒種公豬，就會(huì)將PR流行范圍逐級(jí)放大[6]，導(dǎo)致PR大面積蔓延，從而給PR凈化帶來非常大的困難。

4.2 對(duì)種公豬精液進(jìn)行PRV檢測的必要性

PRV的感染和散毒機(jī)制是急性感染→潛伏感染→激活排毒→再次感染。這一機(jī)制的循環(huán)往復(fù)，導(dǎo)致PRV在豬群中長期存在。PRV潛伏感染的主要部位在神經(jīng)系統(tǒng)，其次是扁桃體和肺等部位[7]。

潛伏的病毒在一定條件下被激活2～5 d后即可形成毒血癥，在豬只未出現(xiàn)臨床癥狀前即通過身體分泌物和排泄物向外散毒，因而需要在感染6～8 d以后才能檢出感染抗體[1]。成年公豬感染PRV后癥狀不明顯。我國多地從未觀察到臨床癥狀的公豬精液中檢測到PRV核酸[8-10]。本研究用熒光PCR方法對(duì)108頭種公豬精液進(jìn)行PRV核酸檢測，僅在二、三級(jí)種公豬場檢出3份陽性樣品。雖然這3份精液對(duì)應(yīng)的血清樣品PRV gE抗體檢測均為陰性，但種公豬所在場均存在PRV潛伏帶毒豬，因此這3頭種公豬很可能處于PRV感染早期。這種PRV gE抗體陰性、精液病原陽性的種公豬是最危險(xiǎn)的傳染源。由于種公豬在PR凈化中起關(guān)鍵作用，建議開展PR凈化時(shí)，不但要進(jìn)行PRV gE抗體檢測，還要對(duì)種公豬精液進(jìn)行病原檢測，從源頭上阻斷PRV傳播。

4.3 疫苗在PR防控中的重要性

由于豬在PRV野毒感染后會(huì)同時(shí)產(chǎn)生PRV gB、gE抗體，因此PRV潛伏感染情況嚴(yán)重的豬場PRV gB抗體可能也較高，所以PR免疫效果要結(jié)合PRV gB、gE抗體以及病原檢測結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估。免疫效果好的種豬場，其PRV野毒感染率也較低。本檢測發(fā)現(xiàn)，一級(jí)場種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gB抗體陽性率分別為100%和97.6%，免疫效果較好，因此在種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬中均未檢出PRV隱性感染。王榮詳?shù)萚11]對(duì)規(guī)?；i場PRV野毒感染情況進(jìn)行了調(diào)查，也發(fā)現(xiàn)抗體陽性率與感染率呈負(fù)相關(guān)，表明疫苗接種在PR防控中起了重要作用。自然基因缺失的PRV弱毒疫苗會(huì)與野毒競爭定植豬的隱性感染靶組織，從而阻斷野毒感染，最適用于PRV隱性感染的控制，同時(shí)弱毒疫苗誘導(dǎo)群體產(chǎn)生的體液免疫、細(xì)胞免疫和局部黏膜免疫能夠阻止感染豬只發(fā)病，降低排毒量，從而有效抑制病毒傳播[12]。Bartha-K61弱毒苗是自然篩選的毒力基因缺失疫苗，在大連市應(yīng)用廣泛。本次檢測的24個(gè)種豬場絕大多數(shù)使用Bartha-K61弱毒苗，但是免疫效果參差不齊。今后需要以一級(jí)場為示范，在其他種豬場推廣科學(xué)的免疫接種程序和生物安全措施，同時(shí)加強(qiáng)監(jiān)測，逐步推進(jìn)全市PR的凈化。

5 結(jié)論

本研究對(duì)大連市24個(gè)種豬場的種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的血清樣品應(yīng)用ELISA方法檢測PRV gE抗體、PRV gB抗體，對(duì)種公豬應(yīng)用熒光PCR試驗(yàn)對(duì)應(yīng)檢測精液中的PRV核酸，根據(jù)檢測結(jié)果綜合評(píng)估種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的PR免疫情況、PRV感染情況。檢測發(fā)現(xiàn)種公豬存在PRV gE抗體陰性、精液PRV核酸陽性的情況，且種公豬PRV感染水平與經(jīng)產(chǎn)母豬PRV感染水平呈正比放大效應(yīng)。因此，PR防控與凈化的關(guān)鍵是要對(duì)種公豬嚴(yán)格管控，對(duì)其不但要進(jìn)行PRV gE抗體檢測，還要進(jìn)行精液PRV核酸檢測，任何一項(xiàng)檢測陽性的種公豬均應(yīng)被淘汰，以便從精源上阻斷PRV傳播。