兩種診斷制品對臨床樣品中布魯氏菌抗體的檢測比較

朱紹輝，宮楓舉，邵 鈺，張如民，邵衛(wèi)星，2，孫學(xué)強，2

（1.青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

布魯氏桿菌（Brucella）是一種細(xì)胞內(nèi)寄生小 球桿狀菌，革蘭氏染色陰性，無莢膜，觸酶、氧化酶陽性，可以在很多種家畜體內(nèi)存活。布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人獸共患傳染病。動物布病以羊、牛居多[1-3]，其臨床主要特征是母畜流產(chǎn)、乳腺炎，以及家畜不育和各種組織（如睪丸、關(guān)節(jié)）炎癥。

布病在國內(nèi)外廣泛流行，至今已有170多個國家和地區(qū)報道發(fā)生過布病[4-5]，嚴(yán)重威脅了人類健康和影響畜牧業(yè)發(fā)展，是國際貿(mào)易檢疫中必檢的傳染病[6]。布病在我國流行已久，被列為二類動物疫病，經(jīng)多年防治，到20世紀(jì)80年代中后期得到有效控制。但近年來，該病在我國北方大部分地區(qū)呈現(xiàn)反彈趨勢，尤其是2000年以后，人間布病成為報告發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[7-8]，2015年人間布病已列全國甲、乙傳染病發(fā)病順位第7位，防控形勢嚴(yán)峻[9]。

我國人間布病疫情主要分布于畜牧業(yè)較為發(fā)達(dá)的北方地區(qū)，且人間布病的發(fā)生與動物布病的發(fā)生呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性，所以從源頭上控制畜間布病是減少人間病例最有效、最根本的措施，因而建立快速、有效的診斷方法迫在眉睫。對于動物布病的診斷，相對病原學(xué)方法而言，血清學(xué)方法因具有快速、簡便、費用低等優(yōu)點，目前仍然是動物布病檢疫最常用的診斷方法[10-13]。根據(jù)國標(biāo)GB/T 18646-2018的規(guī)定，虎紅平板凝集試驗抗原、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病監(jiān)測及泌乳母牛布病診斷的初篩試驗。但是目前這兩種方法存在操作不夠簡便、主觀性太強或檢測范圍存在一定局限性等缺點，因此臨床上急需一種簡便、快速，敏感性和特異性高、檢測范圍廣的診斷方法來替代現(xiàn)有的布病初篩方法。鑒于此，本試驗對布病虎紅平板凝集試驗抗原（RBT）和布病抗體檢測試紙條（GICA）進行了比較，以期為我國布病的臨床診斷和監(jiān)測方法選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

布病虎紅平板凝集抗原、布病試管凝集抗原和布病抗體檢測試紙條：均由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心制備、提供；353份臨床血清（包括96份牛血清、116羊血清和141份豬血清）：均為臨床采集的病料。

1.2 方法

1.2.1 臨床血清樣本檢測和結(jié)果判定 采用布病試管凝集試驗抗原（SAT）對背景清楚的353份臨床血清樣品其進行檢測，依據(jù)國標(biāo)GB/T 18646-2018的規(guī)定進行操作和結(jié)果判定。

1.2.2 敏感性、特異性以及與SAT符合率比對將1.2.1中確診的353份臨床樣品同時采用布病虎紅平板凝集抗原和布病抗體檢測試紙條進行檢測、比對。其中，虎紅平板凝集試驗抗原依據(jù)國標(biāo)GB/T 18646-2018中規(guī)定的方法操作和判定結(jié)果，布病抗體檢測試紙條按照說明書操作和判定結(jié)果，并按公式敏感性Se=a/(a+c)，特異性Sp=d/(b+d)[14-16]，假陽性率=b/(b+d)，假陰性率=c/(a+c)，計算兩種檢測試劑的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率（表1）。按照公式Kappa=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)，計算兩種試劑與SAT結(jié)果間的Kappa值，比較其符合程度。Kappa值為0.81～1.00時，判定兩種方法完全符合；為0.61～0.80時，判定兩種方法高度符合；為0.41～0.60時，判定兩種方法中度符合；為0.21～0.40時，判定兩種方法比較符合；0.20以下為輕度符合；0以下為不符合[17-18]。

表1 敏感性和特異性試驗統(tǒng)計

1.2.3 重復(fù)性試驗比對 隨機選取經(jīng)布病試管凝集試驗抗原確診的布病抗體陽性血清（編號P1～P10）和陰性血清（編號N1～N10）各 10份，采用布病虎紅平板凝集試驗抗原和布病抗體檢測試紙條同時進行重復(fù)性試驗，比對兩者的穩(wěn)定性。即隨機選取同一批次的布病虎紅平板凝集試驗抗原和同一批次的布病抗體檢測試紙條分別檢測上述陽性血清和陰性血清各10份。

2 結(jié)果

2.1 臨床血清樣本檢測

依據(jù)國標(biāo)GB/T 18646-2018規(guī)定的操作方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，采用布病試管凝集試驗抗原對背景清楚的353份臨床血清樣品進行布病抗體的檢測和判定，最終得到23份布病抗體陽性血清（包括19份牛血清、4份羊血清）和330份布病抗體陰性血清（包括80份牛血清、110份羊血清、140份豬血清）。

2.2 敏感性、特異性以及與SAT符合率比對

采用布病虎紅平板凝集試驗抗原檢測已確診過的353份血清，共檢出30份陽性、323份陰性，敏感性為100%（23/23），特異性為97.88%（323/330），假陽性率為2.12%（7/330），假陰性率為0（0/23），與布病試管凝集試驗抗原結(jié)果間的Kappa值為0.86。布病抗體檢測試紙條檢測已確診過的353份血清，共檢出25份陽性、328份陰性，敏感性為100%（23/23），特異性為99.39%（328/330），假陽性率為0.71%（2/330），假陰性率為0（0/23），與布病試管凝集試驗抗原結(jié)果間的Kappa值為0.95（表2）。

表2 兩種檢測試劑比對結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗比對

隨機選取經(jīng)布病試管凝集試驗抗原確診的布病抗體陽性血清和陰性血清各10份，同時采用布病虎紅平板凝集試驗抗原和布病抗體檢測試紙條進行重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，布病虎紅平板凝集試驗抗原和布病抗體檢測試紙條檢測結(jié)果均與布病試管凝集試驗抗原確診結(jié)果一致，即兩種方法的重復(fù)性均良好（表3）。

3 討論

近年來，國內(nèi)外布病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響了人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。2012年國務(wù)院辦公廳印發(fā)《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》，將布病列為優(yōu)先防治和重點防范的人獸共患病之一；2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又印發(fā)《2018年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃》，將布病列為優(yōu)先防治病種，強調(diào)重點做好包括布病在內(nèi)的“3+2”病種監(jiān)測工作。因此，開展監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查，強化監(jiān)測預(yù)警和風(fēng)險分析評估成為相關(guān)部門和畜牧工作者的重中之重，隨之而來的布病的診斷技術(shù)也備受關(guān)注。

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗比對結(jié)果

該病的診斷技術(shù)根據(jù)國標(biāo)GB/T 18646-2018規(guī)定，布病虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病監(jiān)測及泌乳母牛布病診斷的初篩試驗，OIE推薦的間接ELISA和熒光偏振試驗也常被用于布病初篩。但是，在臨床應(yīng)用中，布病虎紅平板凝集試驗結(jié)果判定主觀性太強，容易造成誤診；而乳牛全乳環(huán)狀試驗不適用于患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脫脂乳和煮沸過的乳，也不適用于腐敗、變酸和凍結(jié)過的乳，檢測范圍存在明顯局限性；熒光偏振試驗和ELISA方法操作相對繁瑣，還需配備專門的設(shè)備，對試驗人員要求相對較高，相對來說也不適合臨床即時檢測。所以，布病的臨床診斷更傾向于用一種簡便、快速，敏感性和特異性也較高，適用性更強的診斷方法來替代現(xiàn)有的布病初篩方法。膠體金試紙條憑借其操作方便和判定迅速的優(yōu)勢，在動物疫病檢測中已得到較廣泛的應(yīng)用[20-22]，自然成為備選的替代方法之一。

中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所于2017年成功研制了布魯氏菌抗體金標(biāo)快速檢測卡。該檢測卡應(yīng)用競爭抑制免疫層析原理，特異性較高，但靈敏度相對偏低，存在一定的假陰性率。本研究采用布病抗體檢測試紙條，應(yīng)用間接法免疫層析原理，因而靈敏度和特異性均較高，且待檢樣品稀釋完畢后，可直接將試紙條插入樣品中，臨床使用更方便、快捷，節(jié)省了時間。

選擇優(yōu)質(zhì)的檢測試劑與布病的凈化密切相關(guān)，因而檢測過程中的敏感性、特異性、假陽性和假陰性等問題備受關(guān)注[23-24]。本研究著眼于布病抗體檢測試紙條在確定布病感染過程中的可行性，從試紙條與虎紅平板凝集試驗抗原的敏感性、特異性和與布病試管凝集試驗抗原的Kappa值進行了比對。從試驗結(jié)果來看，兩種方法與布病試管凝集試驗抗原的Kappa值均在0.8以上，重復(fù)性試驗均顯示穩(wěn)定性很好，均可以作為布病的初篩方法，但兩者均存在一定程度的假陽性，且虎紅平板凝集試驗抗原假陽性率（2.12%）稍高于試紙條（0.71%）。虎紅平板凝集試驗抗原出現(xiàn)假陽性的原因主要是受環(huán)境和人為主觀判定標(biāo)準(zhǔn)的影響較大，同時有報道稱某些革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌O157、鼠傷寒沙門氏菌等與布魯氏菌，在虎紅平板凝集試驗中可產(chǎn)生交叉反應(yīng)；試紙條出現(xiàn)假陽性的原因主要是血清可能存在一些交叉反應(yīng)的物質(zhì)。假陽性的存在容易造成布病誤判，從而造成不必要的經(jīng)濟損失，所以假陽性率高低直接硬性診斷試劑質(zhì)量，是診斷試劑選擇的條件之一。

膠體金試紙條相對于虎紅平板凝集試驗抗原檢測成本較高，但運輸、儲存更為方便，操作更為簡單快捷，特異性和靈敏度都較高，假陽性率低，所以布病抗體檢測試紙條在臨床應(yīng)用中具有較大優(yōu)勢，在部分地區(qū)或特殊環(huán)境下可替代虎紅平板凝集試驗抗原用于布病初篩。