高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

高許雷，孫國(guó)強(qiáng)，李永鋒

（1.青島市嶗山區(qū)農(nóng)業(yè)和水利局，山東青島 266061；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）為單股正鏈RNA病毒，屬套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬[1]，主要引發(fā)母豬繁殖障礙，以及仔豬呼吸道癥狀和高病死亡率，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)PRRSV流行毒株以北美洲型為主，病毒基因組含有9個(gè)編碼蛋白的開放閱讀框（ORF），共編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[2]。劉業(yè)兵等[3]認(rèn)為Nsp2蛋白片段缺失了30個(gè)左右的氨基酸是引起高致病性PRRSV出現(xiàn)的原因，而且Nsp2蛋白富含多個(gè)抗原決定簇，能夠誘導(dǎo)高水平抗體。

PRRSV檢測(cè)主要以病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)為主。目前ELISA是檢測(cè)PRRSV抗體最簡(jiǎn)便、快速的方法，適用于大批量血清樣品的監(jiān)測(cè)[4]。國(guó)外學(xué)者Albina等[5]將PRRSV 接種豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMS）制備病毒抗原，首次建立了檢測(cè)PRRSV抗體的間接ELISA方法。在國(guó)內(nèi)，謝銀祿等[6]建立的ELISA方法能檢測(cè)PRRSV抗體；李志杰等[7]根據(jù)PRRSV GP5基因建立了檢測(cè)PRRSV抗體的ELISA方法；張輝等[8]建立了一種根據(jù)NSP7非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)PRRSV抗體的ELISA方法；吳憶春[9]建立了依據(jù)M蛋白檢測(cè)PRRSV抗體的ELISA方法。

目前，雖然高致病性PRRSV滅活疫苗在PRRS防控中發(fā)揮了巨大作用，但國(guó)內(nèi)仍存在使用傳統(tǒng)疫苗（如普通毒株滅活苗及弱毒疫苗）的情況，也并未建立能區(qū)分普通疫苗和高致病性疫苗免疫抗體的ELISA方法。本研究建立了一種鑒別診斷高致病性PRRSV滅活疫苗，以及普通PRRSV滅活苗、弱毒疫苗的ELISA方法，從而豐富了PRRSV抗體檢測(cè)手段，為PRRS防控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

包含目的基因dNsp2（87）重組克隆載體質(zhì)粒（pUC57-dNsp2）：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；固定化鎳離子親和層析試劑盒：購(gòu)自Invitrogen公司；IPTG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬抗體：購(gòu)自Sigma公司；PRRSV陽(yáng)性血清、PRRSV陰 性 血 清、CSFV、PPV、PCV、JEV、PRV陽(yáng)性血清：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 重組蛋白表達(dá)

將pUC57-dNsp2菌接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取10 mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 h，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L，34 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h， 誘導(dǎo)菌4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的蛋白純化和濃縮

將大量誘導(dǎo)pUC57-dNsp2菌進(jìn)行超聲波裂解破碎，離心取上清，用融合蛋白純化試劑盒，對(duì)重組的dNsp2蛋白進(jìn)行純化和濃縮，用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的純化和濃縮情況。

1.4 最佳工作條件確定

將純化蛋白進(jìn)行重組蛋白濃度測(cè)定后，分別進(jìn)行抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的選擇，以及最佳封閉液、最佳封閉時(shí)間、二抗最佳稀釋度、最佳反應(yīng)時(shí)間的確定，最后確定底物的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.5 陰陽(yáng)性臨界值確定

取陰性血清40份，按照建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)，測(cè)定OD450值。根據(jù)結(jié)果計(jì)算出40份樣品的OD450平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）：臨界值=未免疫血清OD450平均值（X）+3×SD。樣本的OD450＞臨界值時(shí)，可判定為陽(yáng)性。

1.6 特異性檢驗(yàn)

將CSFV、PPV、PCV、JEV、PRV陽(yáng)性血清，按建立的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀上讀出OD450值，然后進(jìn)行結(jié)果判定。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按建立的ELISA 檢測(cè)方法，將IDEXX公司PRRSV ELISA Kit鑒定為陰性的8份血清，進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)，測(cè)定OD450值，確定批內(nèi)及批間試驗(yàn)的變異系數(shù)。

1.8 敏感性試驗(yàn)

將高致病性PRRSV陽(yáng)性血清和普通型PRRSV陽(yáng)性血清，用PBST分別進(jìn)行1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640稀釋，按優(yōu)化好的ELISA方法測(cè)定其OD450值，然后進(jìn)行結(jié)果判定。

1.9 符合性試驗(yàn)

按建立的ELISA 檢測(cè)方法與IDEXX PRRSV ELISA Kit進(jìn)行比較，分別對(duì)96份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性符合率和陰性符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白制備及純化

含有目的蛋白的重組菌，經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)純化后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在23.5 ku處出現(xiàn)了明顯條帶，分子質(zhì)量與未純化前的重組蛋白一致（圖1）。

圖1 表達(dá)產(chǎn)物的純化

2.2 純化蛋白濃度測(cè)定

經(jīng)測(cè)定純化蛋白的光密度值OD280=0.089，OD260＝ 0.067， 故 重 組 蛋 白 濃 度（mg/mL）=（1.45×OD280?0.74×OD260）× 稀 釋 倍 數(shù) =（1.450×0.089?0.740×0.067）×50=3.996 mg/mL。

2.3 抗原和血清工作濃度選擇

將純化的重組蛋白進(jìn)行方陣試驗(yàn)，可以看出重組蛋白以1:100稀釋為最佳，即抗原的最適包被濃度為40 μg/mL，待檢血清1:40稀釋為重組蛋白抗原和血清的最佳工作濃度（表1）。

2.4 間接ELISA各項(xiàng)試驗(yàn)條件優(yōu)化

結(jié)果顯示，血清37 ℃作用1 h效果最佳，5%脫脂奶粉37 ℃下封閉2 h效果最好；酶標(biāo)二抗的最佳試驗(yàn)條件為1:5 000稀釋，37 ℃作用1 h；底物最佳顯色時(shí)間為10 min。

表1 重組蛋白抗原最適包被濃度與血清稀釋倍數(shù)確定

2.5 陰陽(yáng)性臨界值確定

按照建立的ELISA方法，將40份血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出40份血清的OD450平均值X＝0.2030，標(biāo)準(zhǔn)方差SD＝0.047，因此臨界值=X+3SD=0.35，即樣本OD450≥0.35，判定為陽(yáng)性；OD450＜0.35，判定為陰性。

2.6 間接ELISA 特異性試驗(yàn)

根據(jù)建立的檢測(cè)方法，分別對(duì)CSFV、PPV、PCV、JEV、PRV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OD450均小于0.4，結(jié)果判為陰性，表明該重組蛋白與上述5種病毒的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，該間接ELISA方法特異性較好（表2）。

表2 間接ELISA 特異性試驗(yàn)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

將 8份血清進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，可以看出不同血清樣品的變異系數(shù)不超過(guò)10%（表3）；進(jìn)行批間重復(fù)性檢測(cè)，可以看出同一血清樣品在不同批試驗(yàn)中的變異程度較?。ū?），具有較好的重復(fù)性。

表3 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 敏感性試驗(yàn)

將PRRSV陽(yáng)性血清倍比稀釋，并進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性血清的檢測(cè)效價(jià)為1:320（表5），說(shuō)明建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性。

2.9 符合性試驗(yàn)

將建立的ELISA檢測(cè)方法與IDEXX PRRSVELISA Kit，對(duì)96份血清進(jìn)行平行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性符合率為92.3%，陰性符合率為91.7%（表6），表明該方法能夠滿足臨床檢測(cè)需要。

表4 批間重復(fù)性試驗(yàn)

表5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表6 符合性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)棋盤滴定法確定了重組蛋白抗原和血清的最佳稀釋倍數(shù)；在37 ℃條件下，對(duì)血清及二抗作用時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，分別于0.5、1、1.5 h時(shí)結(jié)束反應(yīng)，最終確定較佳血清和二抗作用時(shí)間為1 h。

本試驗(yàn)建立的方法與IDEXX PRRSV ELISA Kit抗體檢測(cè)商品化試劑盒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其靈敏度較IDEXX試劑盒低。這一方面可能是因?yàn)樵揈LISA方法的條件還不夠優(yōu)化，另一方面可能是因?yàn)樵撃康牡鞍着c完整的Nsp2蛋白相比，丟掉了部分抗原表位。這也是本方法所測(cè)陽(yáng)性樣品OD450值較PRRSV ELISA Kit試劑盒低的原因。

總體而言，本研究建立的ELISA方法具有較好的特異性、重復(fù)性、敏感性，與IDEXX PRRSV ELISA Kit抗體檢測(cè)商品化試劑盒具有較好的符合性，可用于臨床PRRSV抗體檢測(cè)。