餐飲中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法

董 菁，胡孔興，劉 麗，陳佳峰

(1.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市食品藥品稽查支隊(duì)，安徽 蕪湖 241000)

餐飲是人們賴以生存的基礎(chǔ)，隨著生活節(jié)奏的加快，工作壓力的增加，特別是互聯(lián)網(wǎng)銷售的突起，人們對于大眾化餐飲的需求每年都在呈現(xiàn)上升趨勢，線上訂餐已經(jīng)成為一種流行.蕪湖市餐飲業(yè)更是借著這股春風(fēng)得以迅猛發(fā)展，而蕪湖市餐飲食品的投訴也在呈上升趨勢.投訴內(nèi)容主要是餐飲的不潔加工導(dǎo)致的微生物超標(biāo).餐飲食品中的致病菌常規(guī)檢測項(xiàng)目為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌檢測.金黃色葡萄球菌(Staphylococous Aureus)系微球菌科，兼性厭氧菌，抵抗能力較強(qiáng)，分布較廣，廣泛存在于空氣、塵埃、水以及人和動物的排泄物中,是引起食物中毒的常見致病菌之一，也是蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心在餐飲食品檢測中檢出率最高的致病菌.

據(jù)美國疾病控制中心報(bào)告，在美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量僅次于大腸埃希菌，居第 2位，占細(xì)菌性食物中毒的 33%，而在加拿大則占 45%[1-2].日本的調(diào)查結(jié)果表明，平均 32.5% 的食品存在金黃色葡萄球菌的污染[3-4].2010～2012年北京市共報(bào)告細(xì)菌性食物中毒27起，其中金黃色葡萄球菌食物中毒占22%[5-6].

食源性致病菌快速檢測方法主要有顯色培養(yǎng)基法、電阻抗法、微熱量法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)檢測方法等[7-10].現(xiàn)有的金黃色葡萄球菌國標(biāo)的檢測方法為GB 4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，該標(biāo)準(zhǔn)第一法中金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)從樣品增菌到最后確證鑒定需要5天時間，而且和其他食品相比，餐飲中含有大腸菌群、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌等其他微球菌干擾的情況更為突出，且微球菌屬在Baird-Parker平板上菌落形態(tài)及其相似，不宜區(qū)分，增加了檢測難度.

研究是為了解決現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.10-2016檢測餐飲中金黃色葡萄球菌時間長、干擾大、對檢驗(yàn)人員要求高等問題，將培養(yǎng)基法和免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，建立了一種餐飲中金黃色葡萄球菌快速檢測的方法.通過對2015～2017年蕪湖市餐飲食品中微生物檢驗(yàn)結(jié)果的分析，利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的國標(biāo)檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測時間，減小了檢測難度.

1 材料與方法

1.1 樣品

市售餐飲樣品(主要為盒飯、涼拌菜、餐具).

1.2 培養(yǎng)基和試劑

7.5%氯化鈉增菌肉湯、無菌生理鹽水、Baird-Parker瓊脂平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液、血瓊脂平板、凍干兔血漿(北京陸橋技術(shù)股份有限公司);VITEK 2 GP 鑒定卡(法國生物梅里埃公司);金黃色葡萄球菌選擇性平板.

金黃色葡萄球菌選擇性平板制備方法：自制(配方正在申請專利中).

無菌生理鹽水制備方法：稱取8.5 g氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min.

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(ATCC6538);表皮葡萄球菌(ATCC12228);人葡萄球菌;大腸埃希氏菌(CMCC(B)44102);銅綠假單胞菌(ATCC9027);以上菌種均購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心.

1.4 主要儀器和耗材

均質(zhì)器；恒溫培養(yǎng)箱；VITEK 2 COMPACT(全自動微生物分析系統(tǒng))儀；C-01 2.5L厭氧產(chǎn)氣袋(日本三菱瓦斯);C-43立式培養(yǎng)袋.

2 快速檢測法步驟

(1)增菌.稱取25 g樣品至盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的均質(zhì)袋中，8 000～10 000 r/min均質(zhì)1～2 min后，于36±1 ℃厭氧(將均質(zhì)袋放在立式培養(yǎng)袋中，并將一袋厭氧產(chǎn)氣袋放入，立即將封口封牢，即可達(dá)到厭氧效果)培養(yǎng)18～24 h.

(2)分離.將菌種增殖后的培養(yǎng)物，劃線接種到金黃色葡萄球菌選擇性平板上.36±1 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h.

(3)初步鑒定.金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌選擇性平板上呈圓形，表面光滑、凸起、菌落直徑為2～3 mm,顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外有一清晰透明帶.

(4)確證鑒定.挑取金黃色葡萄球菌選擇性平板上至少5個(不足5個全挑)可疑菌落接種到血平板上，于36±1 ℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察是否溶血，選取溶血的菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自動微生物分析系統(tǒng))儀進(jìn)行生化鑒定.

(5)報(bào)告.在25 g樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌.

3 自制金黃色葡萄球菌選擇性平板驗(yàn)證

將金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌分別挑取菌落0.5～1個溶于3 mL 0.45%的NaCl溶液中，配置成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5～0.63(McF)的菌懸液,用接種環(huán)接種于Baird-Parker平板和自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上，36±1 ℃培養(yǎng)24～48 h.

4 結(jié)果和分析

4.1 結(jié)果

對抽取的餐飲樣品(盒飯50組，餐具50組、涼拌菜50組)利用GB 4789.10-2016和文中所提快速檢測法同時進(jìn)行金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)，兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果如表1所示 .

金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài)分別如圖1和圖3所示.金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在國標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)分別如圖2和圖4所示.金黃色葡萄球菌在血平板的菌落形態(tài)如圖5所示.金黃色葡萄球菌的生化鑒定結(jié)果如表2所示.

4.2 分析

通過對2015～2017年蕪湖市餐飲食品中微生物檢驗(yàn)結(jié)果的分析，利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的國標(biāo)檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了餐飲食品中金黃色葡萄球菌的檢測時間，明顯減少了典型菌落數(shù)的挑取鑒定數(shù)量，且與國標(biāo)法吻合度達(dá)99.33%，對于150組中唯一不符合的一組盒飯進(jìn)行分析,結(jié)果如表1所示.由表1可知，在用國標(biāo)法檢測該盒飯樣品時，該盒飯樣品含有大腸菌群、表皮葡萄球菌數(shù)量較多，對金黃色葡萄球菌可能產(chǎn)生了抑制作用，表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)極其相似，且表皮葡萄球菌在血平板上也能產(chǎn)生完全透明溶血圈，造成檢測難度，報(bào)告了一個假陰性的結(jié)果.

表1 國標(biāo)法和本法檢測情況對比

圖1 金黃色葡萄球菌在自制的金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài) 圖2 金黃色葡萄球菌在國標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)

圖3 表皮葡萄球菌在自制金黃色葡萄球菌選擇性平板上的菌落形態(tài) 圖4 表皮葡萄球菌在國標(biāo)法Baird-Parker平板上的菌落形態(tài)

圖5 金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)

表2 VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)儀生化鑒定金黃色葡萄球菌陽性結(jié)果

Biochemical Details2AMY-4PIPLC-5dXYL-8ADH1+9BGAL-11AGLU-13APPA-14CDEX-15AspA-16BGAR-17AMAN-19PHOS+20LeuA-23ProA-24BGURr-25AGAL-26PyrA+27BGUR+28AIaA-29TyrA-30dSOR-31URE-32POLYB+37dGAL+38dRIB-39ILATk+42LAC-44NAG+45dMAl-46BACI+47NOVO-50NC6.5+52dMAN+53dMNE+54MBdG-56PUL-57dRAF-58O129R+59SAL-60SAC+62dTRE+63ADH2s-64OPTO+

研究提供的方法在菌種增殖和分離時采用厭氧培養(yǎng)，有效阻止了餐飲中其他需氧菌(主要為大腸菌群)的生長，在分離時采用的金黃色葡萄球菌選擇性平板對金黃色葡萄球菌有很好的選擇性.餐飲易污染的其他微球菌，如表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、中間葡萄球菌等在該平板上生長情況較差，甚至不生長.將血平板的接種放在金黃色葡萄球菌選擇性平板接種之后進(jìn)行，對于不溶血的可疑菌落不用再做鑒定試驗(yàn)，減少了工作量并縮短了檢驗(yàn)周期.最終生化鑒定采用VITEK 2 COMPACT(全自動微生物分析系統(tǒng))儀，而不是國標(biāo)法的血漿凝固酶試驗(yàn)，又可以減去每半小時觀察凝固現(xiàn)象的繁瑣環(huán)節(jié)和結(jié)果不理想的重復(fù)試驗(yàn)次數(shù).

對典型菌落確認(rèn)時，快速檢測法只需對血平板上的典型菌落利用VITEK 2 COMPACT(全自動微生物分析系統(tǒng)儀)進(jìn)行確認(rèn)，而國標(biāo)法(GB 4789.10-2016)需要對血平板和Baird-Parker平板上的典型菌落染色鏡檢，挑取鏡檢為革蘭氏陽性球菌的菌落接種到5 mL的BHI和營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24 h后，再進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn).在對150組餐飲樣品的檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對于金黃色葡萄球菌檢出率最高的50組涼拌菜，國標(biāo)法用于鑒定的菌落數(shù)分別是：血平板上85個，Baird-Parker平板上105個；快速檢測法用于鑒定的菌落數(shù)僅是：血平板上33個；國標(biāo)法陽性菌和用于鑒定的菌落數(shù)的比率(見表1)也明顯低于快速檢測法.這主要是因?yàn)椴惋嬍称废鄬ζ渌称范?，被大腸菌群和其他微球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等) 同時污染的情況更為常見，典型菌落種類更多，所以利用國標(biāo)法檢測餐飲食品中的金黃色葡萄球菌就會更繁瑣，并且工作量會成倍增長.

5 結(jié)論

與現(xiàn)有技術(shù)相比，研究利用了金黃色葡萄球菌為需氧兼性厭氧菌以及其代謝產(chǎn)物中能產(chǎn)生血漿凝固酶的特點(diǎn)，自制了選擇性和抗干擾性明顯優(yōu)于國標(biāo)法Baird-Parker平板的金黃色葡萄球菌選擇性平板，對于不溶血的可疑菌落不用再做鑒定試驗(yàn)，縮短了金黃色葡萄球菌的檢測時間，減小了檢測難度，提高了準(zhǔn)確性.