穩(wěn)定表達人巨噬細胞集落刺激因子的L929細胞株的建立*

陸 琤 周晨辰 張鵬飛 張 硌 張 鵬*

L929細胞是小鼠表皮成纖維細胞，L929細胞培養(yǎng)上清中含有較高濃度的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)[1]。M-CSF是一種由成纖維細胞或上皮細胞等產(chǎn)生的細胞因子，能調(diào)節(jié)巨噬細胞的生存、增值和分化。使用含L929上清的條件培養(yǎng)基與重組M-CSF誘導(dǎo)分化獲得的骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)在形態(tài)、純度、殺菌能力和吞噬細菌能力等方面無顯著差異[2]。因此，含L929上清的條件培養(yǎng)基可用來代替昂貴的重組M-CSF誘導(dǎo)分化骨髓巨噬細胞。但該條件培養(yǎng)基僅限用于誘導(dǎo)分化鼠的巨噬細胞，并不能用于人的巨噬細胞的培養(yǎng)?；诖耍狙芯客ㄟ^慢病毒重組系統(tǒng)將人M-CSF基因重組入L929的基因組中，使其能高效表達人巨噬細胞集落刺激因子(human macrophage colonystimulating factor，hMCSF)，為體外培養(yǎng)人源的巨噬細胞提供廉價又方便的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

包裝質(zhì)粒pMD、SPA為本實驗室保存，載體質(zhì)粒pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA由北京梓熙生物科技有限公司合成。293TX細胞和L929細胞為本實驗室保存。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine2000)購自美國Invitrogen Life Technologies公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；血清購自美國Hyclone；0.22 μm濾器購自美國PALL公司；超濾離心管購自美國millipore公司。增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)顯影試劑購于美國Thermo公司，其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 載體質(zhì)粒pCDH-hMCSF-HA的構(gòu)建

從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站上找到hMCSF序列后連接血凝素抗原(hemagglutinin antigen，HA)標簽蛋白便于蛋白質(zhì)印跡(western blot，WB)檢測。將該目的基因片段插入載體pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro的EcoR1/BamH1兩個酶切位點之間，該載體質(zhì)粒pCDH-hMCSF-HA交由北京梓熙生物科技有限公司合成。

1.3 慢病毒包裝

293TX細胞于對數(shù)生長期時接種于60 mm直徑的培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(dulbecco"s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)。將1μg pMD、3μg SPA、4μgpCDH-X/pCDH-hMCSF與100 μl無血清1640培養(yǎng)基溫和混勻，Lipofectamine 2000 16 μl與100 μl無血清1640培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置5 min，再將二者混勻，室溫靜置20 min，將混合液緩慢滴入293TX細胞中，即完成包病毒過程。轉(zhuǎn)染后8 h或過夜后換液，24～36 h收一次上清，補液5 ml。約72 h后再收上清，3000 r/min離心5 min，使得細胞等雜質(zhì)沉淀，取上清用0.22 μm濾器過濾后加入超濾離心管，5000 r/min，離心20 min后得約200 μl濃縮病毒，置于-40 ℃保存或立刻使用。

1.4 L929細胞培養(yǎng)及感染

取適量L929細胞接種于60 mm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入含20%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。當細胞長至對數(shù)增長期時，取少量接種至12孔板中的一孔，加入濃縮病毒約20 μl，感染后72 h，在倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)光(450～490 nm藍光波長)照射下，觀察L929感染情況。加入嘌呤霉素篩選感染成功的細胞，終濃度為20 ng/ml。第2 d更換培養(yǎng)液，未感染成功的細胞已被殺死，感染成功的細胞完好，待感染成功的細胞長滿后，將其接種入新的60 mm直徑的培養(yǎng)皿中進行擴大培養(yǎng)。

1.5 WB方法檢測hMCSF表達

取適量過表達pCDH-X、pCDH-hMCSF-HA的L929細胞，并收集其上清，制成上樣液，用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)凝膠分離；90 mA，3 h電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；用5%脫脂奶，水平脫色搖床室溫震蕩封閉1 h；與1∶1000稀釋后的HA一抗4 ℃孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷鹽吐溫(tris buffered saline tween，TBST)緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗，水平脫色搖床室溫孵育1 h；TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min；用增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)試劑盒顯影并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染L929細胞結(jié)果

(1)用于包病毒的載體pCDH-X/pCDH-hMCSFHA能夠表達綠色熒光蛋白，因此未被慢病毒感染的L929在熒光顯微鏡下不發(fā)光(如圖1所示)。

(2)被病毒pCDH-X感染過的L929在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光，表明病毒感染成功(如圖2所示)。

圖1 未處理的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

圖2 過表達pCDHX的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

(3)被病毒pCDH-hMCSF-HA感染過的L929在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光，表明病毒感染成功(如圖3所示)。

圖3 過表達pCDH-hMCSF-HA的L929細胞熒光顯微鏡圖(×40)

2.2 WB檢測結(jié)果

WB結(jié)果顯示，過表達pCDHX的L929細胞培養(yǎng)上清(L929pCDH-X SUP)和細胞裂解液(L929pCDH-X CELL)檢測不到特異性條帶，而在過表達pCDH-hMCSF-HA的L929細胞的培養(yǎng)上清(L929pCDH-hMCSF-HA SUP)和細胞裂解液(L929PCDH-hMCSFHA CELL)中檢測到特異性條帶，且L929PCDH-hMCSF-HA SUP中檢測到的特異性條帶比L929pCDH-hMCSF-HA CELL稍大，是因為M-CSF是一種由鏈間二硫鍵連接而成的同源二聚體糖蛋白，由于其糖基化和蛋白水解等翻譯后修飾會產(chǎn)生不同的可溶性形式，分子量為40～90 kDa[3-8]。本研究結(jié)果檢測到的特異性條帶大小符合上述范圍(如圖4所示)。

圖4 western blot檢測上清及細胞中hMCSF的表達示圖

3 結(jié)論

本研究在設(shè)計載體質(zhì)粒pCDH-hMCSF時，在目的基因hMCSF后連入HA標簽蛋白。HA標簽蛋白，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，為9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小，易于用Anti-HA抗體檢測。

本研究采用嘌呤霉素作為抗性篩選劑，是由于pCDH載體上含有嘌呤霉素抗性基因，因此加入終濃度為20 ng/ml的嘌呤霉素可篩除未感染成功的細胞。加入嘌呤霉素后存活的細胞生長較好，與野生型的L929細胞相比，在形態(tài)上及生長速度上無明顯差異。

hMCSF具有能夠刺激巨噬細胞生長和分裂的功能，臨床及科研中均具有重要的應(yīng)用價值和前景。天然來源的M-CSF含量低，且分離純化不易，因而價格昂貴[9-10]。體外培養(yǎng)巨噬細胞的傳統(tǒng)方法主張每2～3 d補加細胞因子，以保證足夠的細胞因子濃度，但這種方法花費巨大。而L929細胞增殖速度快，耐受力強，容易培育，通過慢病毒感染的L929細胞能高效表達人源M-CSF，可替代價格昂貴的細胞因子，其方法的培養(yǎng)來源于人體的巨噬細胞，比來源于鼠的巨噬細胞更接近人體機能，可作為體外研究的材料而進一步為研究巨噬細胞生物學(xué)作用創(chuàng)造條件。