IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用探討

周珺　　袁遠(yuǎn)

[摘要] 目的 探討IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用。 方法 選取2016年9月～2017年9月來(lái)我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者（觀察組）和同期來(lái)我院體檢的30例健康者（對(duì)照組）為研究對(duì)象，觀察組患者給予地塞米松進(jìn)行治療，采集治療前后血液樣本，比較分析血漿中Kyn、Trp、 Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞中TTS、IDO的表達(dá)。 結(jié)果 治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療前，觀察組CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞中IDO水平顯著高于對(duì)照組，TTS水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效組患者CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療無(wú)效組患者治療前后各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著差異（P>0.05）。 結(jié)論 IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑與免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病相關(guān)，也可通過(guò)IDO/TTS評(píng)價(jià)患者的臨床療效，具有指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞] IDO；TTS；色氨酸；免疫性血小板減少癥

[中圖分類號(hào)] R558.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）17-0118-04

Exploration of the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia

ZHOU Jun YUAN Yuan

Clinical Laboratory， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia. Methods 30 patients with immune thrombocytopenia（observation group） who came to our hospital from September 2016 to September 2017 and 30 healthy people（control group） who had physical examination in our hospital during the same period were selected as the study subjects. Patients in the observation group were treated with dexamethasone， and the blood samples before and after treatment were collected. The levels of Kyn， Trp， Kyn/Trp in the plasma， and the expressions of TTS and IDO in CD4+ and CD8+ T lymphocytes were analyzed and compared. Results Before treatment， the levels of Kyn， Trp and Kyn/Trp in the observation group were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， the Trp level was decreased in plasma in the effective group. The levels of Kyn and Kyn/Trp were increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）； before treatment， IDO levels in CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the observation group were significantly higher than those in the control group. The level of TTS was significantly lower than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， IDO levels in the CD4+ and CD8+T lymphocytes in the effective group were increased， and the level of TTS was decreased. The differences were statistically significant（P<0.05）； there was no significant difference in each index before and after treatment in the ineffective treatment group（P>0.05）. Conclusion The IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway is associated with the onset of immune thrombocytopenia. IDO/TTS can also be used to evaluate the clinical efficacy of patients， with guiding significance.

[Key words] IDO； TTS； Tryptophan； Immune thrombocytopenia

原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）[1，2]，既往稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，屬于獲得性自身免疫性疾病之一[3]。目前認(rèn)為ITP的發(fā)病機(jī)制是由于患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞異?；罨珺淋巴細(xì)胞被激活[4，5]，患者對(duì)自身血小板抗原免疫失耐受，產(chǎn)生針對(duì)自身血小板抗原的免疫性抗體，通過(guò)體液免疫、細(xì)胞免疫，導(dǎo)致患者體內(nèi)血小板的過(guò)度破壞和生成受抑，血小板減少，伴或不伴皮膚黏膜出血，是臨床常見(jiàn)的出血性疾病之一[6]。色氨酸（tryptophan，Trp）是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的必需氨基酸，參與多種組織器官的代謝，吲哚胺2，3-雙加氧酶（ndoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）是Trp沿犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）代謝的關(guān)鍵酶[7]，而當(dāng)Trp濃度降低時(shí)，可抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。目前，臨床上對(duì)于ITP主要給予地塞米松進(jìn)行治療[8，9]，本研究通過(guò)觀察健康人和ITP患者，以及ITP患者治療前后血漿中Kyn、Trp、Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞中TTS、IDO的表達(dá)，旨在探討IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月～2017年9月來(lái)我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者和同期來(lái)我院體檢的30例健康人為研究對(duì)象，其中免疫性血小板減少癥患者為觀察組，健康體檢者為對(duì)照組。其中，觀察組男13例，女17例；年齡12～67歲，平均（32.8±4.0）歲。對(duì)照組男14例，女16例；年齡11～68歲，平均（32.6±4.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有觀察組患者均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[11]中原發(fā)免疫性血小板減少癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中血小板為（0～59）×109/L，血小板平均計(jì)數(shù)為（16.8±2.0）×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他自身免疫性疾病患者；②糖尿病、高血壓等慢性疾病患者；③肺結(jié)核、消化性潰瘍、肝炎等感染性疾?。虎芙?個(gè)月內(nèi)無(wú)糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療史。兩組患者在性別、年齡等一般資料上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

觀察組患者給予40 mg/d地塞米松（廣西萬(wàn)德藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20113234，規(guī)格：5 mg/1 mL）+200 mL生理鹽水中靜滴，療程為4 d[12]，采集健康體檢者以及治療前和治療后5 d免疫性血小板減少癥患者的肝素血液樣本。

1.3 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)患者的臨床療效結(jié)果，分為完全緩解、有效、無(wú)效三個(gè)等級(jí)，完全緩解：患者無(wú)出血，且血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L；有效：患者無(wú)出血，且血小板計(jì)數(shù)≥30×109/L或增加2倍；無(wú)效：患者有出血或血小板計(jì)數(shù)<30×109/L。臨床有效率=（完全緩解例數(shù)+有效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%[10]。

1.4 處理方法

1.4.1 液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析 通過(guò)液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)（LC-MS/MS）比較分析血漿中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的濃度以及Kyn/Trp的比值。具體方法為：將經(jīng)抗凝處理后的100 μL血漿樣品加入200 μL乙腈中，渦旋混勻，靜置，以14000 r/min的速度離心30 min，取上清，加入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分析。設(shè)置流速度為0.2 mL/min，其中，流動(dòng)相A相為乙腈：水=5：95；流動(dòng)相B相：乙腈：水=95：5（A、B相均含0.1%的甲酸）。

1.4.2 流式細(xì)胞儀分析 通過(guò)流式細(xì)胞儀比較分析CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達(dá)。具體方法為：取10 mL的肝素抗凝血，分離外周單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，加入固定劑，渦旋混勻固定，每管中各加入5 μL抗體，4℃避光孵育30 min。加入500 μL的固定劑，室溫渦旋混勻固定后PBS洗滌。加入200 μL破膜劑，以1500 r/min的速度離心15 min，棄上清。每管加4 μL的IDO抗體，及5 μL的TTS抗體，室溫避光孵育。再次加破膜劑、PBS洗滌后重懸細(xì)胞，加5 μL二抗，4℃避光孵育，將處理好的樣品加入BD CantoⅡ流式細(xì)胞儀中檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中TTS、IDO的表達(dá)，通過(guò)FACS Diva7.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析，以熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中TTS、IDO的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組患者臨床療效情況

經(jīng)地塞米松治療后，免疫性血小板減少癥患者中15例完全緩解，8例有效，7例無(wú)效，患者的臨床有效率為76.67%。

2.2 治療前后血漿Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平情況比較

治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效觀察組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），無(wú)效觀察組患者血漿中Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 治療前后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO、TTS的表達(dá)水平情況

治療前，觀察組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO水平顯著高于對(duì)照組，TTS水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效觀察組患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療無(wú)效觀察組患者治療前后CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO、TTS水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的出血性疾病[13，14]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，早期大多數(shù)學(xué)者傾向于是由于患者的體液免疫，患者體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的血小板抗體，導(dǎo)致血小板的過(guò)多破壞[15，16]，而近年來(lái)，學(xué)者們更傾向于是由于患者細(xì)胞免疫，其自身的CD4+T淋巴細(xì)胞是觸發(fā)患者體內(nèi)血小板自身免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，而CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致患者血小板的破壞增加，加重疾病。色氨酸（tryptophan，Try）是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的必需氨基酸，犬尿氨酸途徑是Try最主要的代謝途徑，人體內(nèi)約95%的Try經(jīng)此途徑代謝，Try在吲哚胺-2，3-雙加氧酶（Indoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）的作用下生成甲酰犬尿氨酸，后者迅速在犬尿氨酸甲酰胺酶的作用下生成犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）。IDO是含亞鐵血紅素的單肽鏈[17]，是Trp代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[18]，Trp是細(xì)胞維持正常生理功能必不可少的氨基酸之一，IDO介導(dǎo)的色氨酸代謝在調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和感染中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Trp濃度降低時(shí)，細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞處于靜止期，阻斷T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答。TTS能夠催化Trp與其結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)Trp的儲(chǔ)備，調(diào)節(jié)Trp的代謝過(guò)程，調(diào)控免疫應(yīng)答[19]。IDO和TTS通過(guò)參與Trp代謝過(guò)程而參與多種自身免疫性疾病的調(diào)控，Kyn/Trp值是IDO活性的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。目前臨床上對(duì)于ITP缺乏特異性的治療方法，常用的治療方案包括糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、人免疫球蛋白、促血小板生成素等。地塞米松是目前臨床上公認(rèn)的用于治療免疫性血小板減少癥的藥物，其療效顯著、起效時(shí)間短、副作用少等優(yōu)點(diǎn)[20，21]。ITP患者存在IDO和TTS表達(dá)的異常，地塞米松治療對(duì)IDO/TTS代謝途徑是否有影響，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究中，選取2016年9月～2017年9月來(lái)我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者和同期來(lái)我院體檢的30例健康者為研究對(duì)象，其中免疫性血小板減少癥患者為觀察組，健康體檢者為對(duì)照組，觀察組患者給予地塞米松進(jìn)行治療，采集健康體檢者以及治療前和治療后5 d免疫性血小板減少癥患者的血液樣本，通過(guò)液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)（LC-MS/MS）比較分析血漿中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的濃度以及Kyn/Trp的比值，通過(guò)流式細(xì)胞儀比較分析CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達(dá)。結(jié)果顯示：治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療前，觀察組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO水平顯著高于對(duì)照組，TTS水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后，有效組患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療無(wú)效組患者治療前后血漿Kyn、Trp、Kyn/Trp水平，以及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中IDO、TTS水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。

綜上所述，IDO/TTS介導(dǎo)的色氨酸代謝途徑與免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病相關(guān)，也可通過(guò)IDO/TTS評(píng)價(jià)患者的臨床療效，具有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2018-01-31）