AFB1和ZEN對HepG2細(xì)胞體外聯(lián)合毒性效應(yīng)及機制研究

任亞林 李耘 吳靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

真菌毒素是真菌的次級代謝產(chǎn)物，在食品中復(fù)合污染現(xiàn)象極為普遍，在東南亞、南歐和北美糧油產(chǎn)品中AFB1和ZEN兩種毒素檢出率分別高達(dá)65%、41%、49%和8%、87%和52%［1］。此外，肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是威脅全球公眾健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，每年大約有60萬人死于HCC［2-4］。在我國，HCC僅次于肺癌，死亡率高達(dá)14.56%，并呈上升趨勢，導(dǎo)致HCC的因素非常復(fù)雜，其中通過膳食攝入真菌毒素是關(guān)鍵暴露途徑，尤其是多種毒素的聯(lián)合暴露，但該因素常常被忽略［4］。

AFB1已被明確為I類致癌物，全球大約4.6%-28.2%的HCC由AFB1攝入引起［5］。同時，其他多項研究表明與AFB1產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)的ZEN也可誘導(dǎo)隨后肝病變和HCC的發(fā)生［3，7-8］。當(dāng)前主要認(rèn)同聯(lián)合肝毒性分子機制大體可描述為：抑制線粒體功能，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂，凋亡通路被激活，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制或激活特異性酶功能（如P450）導(dǎo)致免疫功能障礙和代謝失調(diào)，發(fā)生肝損傷及后期癌變等［9］。其中凋亡路徑是影響肝毒性聯(lián)合效應(yīng)主要通路之一，凋亡基因Bax與caspases-3等，以及代謝活性表達(dá)基因P450等起到至關(guān)重要的作用［10］。Xu等［11］利用人源原代肝細(xì)胞針對四環(huán)素等300余種具有肝毒性藥物進(jìn)行體外高內(nèi)涵（HCS）高通量測試，并與臨床結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)線粒體損傷（Mito）、氧化應(yīng)激（ROS）、胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量是表針肝毒性3個最重要的特征指標(biāo)，假陽性率低至0-5%。Li等［12］采用組合熒光探針標(biāo)記的HTS結(jié)合模型預(yù)測實現(xiàn)了多種生物毒素聯(lián)合肝毒性效應(yīng)的合理估計及預(yù)測。但基于HepG2肝癌細(xì)胞，從凋亡通路基因表達(dá)、亞細(xì)胞早期損傷及細(xì)胞凋亡結(jié)局等層面來探討聯(lián)合肝毒性還較少?；诖?，本研究擬采用高內(nèi)涵篩選、RT-PCR手段并結(jié)合CI指數(shù)模型及Tukey HSD多重分析比較等，研究“AFB1+ZEN”單一及復(fù)合作用于HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)的聯(lián)合肝毒性效應(yīng)及可能的機制，結(jié)果為多種真菌毒素聯(lián)合毒性的識別及風(fēng)險管控措施的制定提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素溶液（PS）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購自Gibco公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；熒光探針：HCS NuclearMaskTMDeep Red Stain（NDR）、CellROX Green Reagent（CellROX）、monochlorobimane（mBCL）、Mitotracker red（Mito）以及高純總RNA快速提取試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA synthesis Kit、qPCR試劑FastStart Universal SYBR GreenMaster（ROX）購自Roche公司。

OperettaTM高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（High Content Screening）， 美 國 Perkin Elmer公 司；7500 Fast Real-Time PCR儀，美國Applied Biosystems公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計和CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scienti fi c公司；Countstar全自動細(xì)胞計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 液氮中取出凍存的HepG2細(xì)胞，懸浮放置37℃水浴鍋內(nèi)，并于1 min內(nèi)快融，1 000 r/min離心3 min，無菌操作條件下，棄上清液，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸吹打均勻。將HepG2細(xì)胞利用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于飽和濕度5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞為貼壁生長，每隔2 d可傳代培養(yǎng)。傳代時1 mL胰蛋白酶液消化2 min，待細(xì)胞變圓同時出現(xiàn)間隙，立刻加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，2 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打均勻后將其分裝至2瓶。

1.2.2 細(xì)胞活性試驗 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化、收集制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度并以1×104個/孔接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待其貼壁更換含有不同濃度AFB1、ZEN及其聯(lián)合組的培養(yǎng)液，其中單一染毒條件是AFB1和ZEN的終濃度均分別為 ：1、2、4、5、8、10 μg/mL，以確定IC50；聯(lián)合染毒以單一真菌毒素的IC50為基準(zhǔn)，做等毒1∶1混合，并以2倍梯度稀釋，共設(shè)5個梯度；單一及聯(lián)合染毒每孔均加入藥液100 μL，所需濃度梯度以含有0.1%DMSO培養(yǎng)基稀釋。對照組每孔加入等體積含有0.1%DMSO的培養(yǎng)基，空白組只加入等體積培養(yǎng)液，實驗組與對照組均設(shè)6個平行。高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)選擇DPC明場通道、20×物鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每孔選取23個視野觀察并計算，AFB1、ZEN的IC50通過GraphPad Prism 7.04軟件計算獲取。進(jìn)行3次獨立重復(fù)試驗驗證試驗結(jié)果。

1.2.3 CI模型評估聯(lián)合肝毒性 組合指數(shù)（combination index，CI）是在半數(shù)效應(yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的不依賴于作用模式，用于估計混合物聯(lián)合毒性指數(shù)的模型，可定性評估聯(lián)合毒性相互作用模式（協(xié)同、增毒或拮抗）和定量評估相互聯(lián)合作用的大小，已廣泛用于多種藥物聯(lián)合用藥的安全性評價及研究。對于n種藥物組合，分析模型有：

其中，n（CI）x表示n種真菌毒素的混合物產(chǎn)生x%細(xì)胞抑制率下的組合指數(shù)；（Dx）1-n是x%細(xì)胞損失率下n種真菌毒素混合物濃度之和；{（［D］j）∑1n［D］}是x%細(xì)胞損失率下每種真菌毒素的比例；Dm是中值效應(yīng)劑量；（Dm）j{（fax）j/［1-（fax）j］}1/mj表示單一真菌毒素產(chǎn)生x%細(xì)胞損失率下的濃度水平。AFB1、ZEN的聯(lián)合作用模式可由CompuSyn軟件 2.0 計算［13］。

1.2.4 高內(nèi)涵篩選分析 組合篩選熒光探針NDR（Ex/Em 638/686 nm），CellROX（Ex/Em 504/529 nm），mBCL（Ex/Em 380/461 nm）和Mito（Ex/Em 579/599 nm），分別標(biāo)記細(xì)胞核、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）和線粒體膜電位（MMP）等肝毒性敏感指針。將稀釋的探針逐次加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基中制備熒光探針混合物。然后按照1.2.2方法，將AFB1、ZEN單獨及聯(lián)合染毒HepG2細(xì)胞，分別處理3 h、6 h和24 h后更換熒光探針混合物，共孵育30 min，棄液，用PBS清洗2-3次。上述過程均在避光條件下操作。選擇適當(dāng)熒光通道，20×物鏡下，每孔選取7個視野觀察和計算。ROS、GSH和MMP熒光強度用HCS中Harmony軟件進(jìn)行分析，進(jìn)行3次獨立重復(fù)試驗驗證試驗結(jié)果。

1.2.5 總RNA提取及RT-PCR 按照1.2.4的方法，以AFB1、ZEN的IC50單獨劑量和1∶1等毒聯(lián)合組處理HepG2細(xì)胞，分別作用3 h、6 h和24 h后吸除培養(yǎng)基。用Trizol法抽提細(xì)胞中總RNA，取少量用NanoDrop測定其OD值，確定DNA濃度水平，其余于-80℃冰箱內(nèi)保存。采用Transcriptor First Strand cDNA synthesis Kit進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，并于-20℃下保存。按SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，用熒光定量PCR儀檢測基因表達(dá)強度 Ct值，按 2-ΔΔCt方法計算［14］，進(jìn)行 3次獨立重復(fù)試驗取平均值。設(shè)計上下游引物和內(nèi)參引物序列如表1所示。

表1 基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 AFB1和ZEN聯(lián)合肝毒性效應(yīng)

不同濃度AFB1、ZEN單獨處理HepG2細(xì)胞24 h，基于HCS計算得出AFB1和ZEN的IC50分別為6.29 μg/mL、7.44 μg/mL。由圖 1-A 可見，隨著 AFB1、ZEN濃度升高，在較低濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞損失率變化趨勢更為顯著。根據(jù)CI模型評估聯(lián)合組濃度、fa（效應(yīng)水平）和CI指數(shù)之間的關(guān)系（圖1-B），總體趨勢隨著混合物濃度的升高，fa不斷增強，當(dāng)fa=0.05時，呈現(xiàn)輕微拮抗作用；而當(dāng)fa＞0.05時，在實驗濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)增毒及協(xié)同效應(yīng)，且隨fa增強，由輕微增毒逐步過渡至協(xié)同效應(yīng)且逐步增強。

圖1 AFB1、ZEN單一及聯(lián)合肝毒性效應(yīng)

2.2 亞細(xì)胞層面早期損傷

早期毒性損傷指標(biāo)ROS、GSH和MMP以每個細(xì)胞熒光強度均值相對于空白熒光強度來表征。圖3所示，AFB1和ZEN單一及聯(lián)合處理細(xì)胞，ROS水平均隨毒素處理時間的延長而上升，而GSH和MMP水平呈現(xiàn)逐步下降趨勢。不同處理時間的差異基于Tukey HSD多重分析比較進(jìn)行評價，單一及聯(lián)合處理條件下，3 h時，ROS均很快上升至較高水平，而后隨處理時間延長，其上升趨勢逐步緩慢；處理3-6 h，ZEN與ZEN+AFB1聯(lián)合組差異不顯著，而與AFB1相比呈現(xiàn)顯著差異；6-24 h，3組均具有顯著差異。對于GSH而言，ZEN及AFB1+ZEN組隨處理時間延長GSH變化差異顯著，而AFB1單獨處理細(xì)胞，染毒0-3 h內(nèi)下降趨勢較為顯著，3-6 h趨勢減緩，繼續(xù)延長染毒時間下降趨勢又顯著增強；MMP變化趨勢與GSH類似。

2.3 相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖4-A可見，相比對照組，ZEN、AFB1與AFB1+ZEN作用3-6 h后，Bax相對表達(dá)量均下調(diào)，而作用6-24 h，表達(dá)量上調(diào)；同時，Bax相對表達(dá)量變化總體趨勢與GSH、MMP的變化趨勢同步。由圖4-B AFB1、ZEN單獨及其聯(lián)合均上調(diào)Caspase-3基因相對表達(dá)量，但不同時間組，該差異不顯著。

CYP1A2、CYP2A6和 CYP3A4同為 p450基因家族中的一員，結(jié)合圖4-C、D、E可見，AFB1處理3 h時，3種基因表達(dá)均呈下調(diào)；隨后3種基因表達(dá)變化趨勢出現(xiàn)差異，其中CYP1A2和CYP2A6表達(dá)量快速上升，24 h又恢復(fù)至接近3h表達(dá)水平，而CYP3A4基因表達(dá)量在6-24 h一直維持上調(diào)。

3 討論

目前聯(lián)合毒性研究主要基于體外敏感細(xì)胞系，并采用MTT法、中性紅法和CCK-8法等活力測定來實現(xiàn)評價，但已有研究表明上述方法在精準(zhǔn)度上依然存在不足［15］。此外，傳統(tǒng)體外細(xì)胞毒性評價表征晚期毒性，對亞細(xì)胞及早期損傷信號的捕獲及過程呈現(xiàn)上嚴(yán)重不足，機制闡述具有嚴(yán)重局限性。本研究利用HCS手段結(jié)合RT-PCR，通過對關(guān)鍵凋亡基因、亞細(xì)胞早期損傷指針及細(xì)胞損失率等，分析AFB1、ZEN單一及聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞的聯(lián)合肝毒性效應(yīng)及可能的機制。

圖2 單一及聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞，ROS、GSH、MMP強度隨時間變化影響及HCA圖像

CI模型評估結(jié)果顯示，試驗濃度范圍內(nèi)，隨濃度水平的升高，AFB1+ZEN聯(lián)合毒性由弱拮抗效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樵龆局敝羺f(xié)同效應(yīng)。有研究表明［16］，豬腎臟細(xì)胞系（PK-15）聯(lián)合暴露于AFB1+ZEN，低濃度水平下產(chǎn)生拮抗作用，但劑量提高至5 μmol/L和10 μmol/L則產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。AFB1+ZEN+DON三元組合作用于BRL 3A細(xì)胞系，低劑量水平下也表達(dá)為拮抗效應(yīng)而高濃度下呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)［17］。因此，總體表明，隨濃度的升高，真菌毒素聯(lián)合暴露組作用細(xì)胞的聯(lián)合毒性呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)向協(xié)同效應(yīng)轉(zhuǎn)變的趨勢，但具體發(fā)生的拐點根據(jù)具體暴露組合、劑量水平、作用時間、作用方式下以及細(xì)胞系酶代謝活性及能力不同而不同，聯(lián)合毒性的強度也會呈現(xiàn)差異，甚至差異性較大。

圖3 AFB1和ZEN單獨及聯(lián)合組作用于HepG2細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)影響

AFB1和ZEN作用于HepG2細(xì)胞，呼吸鏈Complex I和Complex III反應(yīng)產(chǎn)生ROS以應(yīng)對外源刺激，胞內(nèi)GSH可不斷清除代謝過程中產(chǎn)生的ROS，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)處于相對動態(tài)、平衡和穩(wěn)定的水平。由于線粒體缺乏谷胱甘肽合成酶，因此mGSH和GSH在細(xì)胞質(zhì)中合成，但AFB1、ZEN作用細(xì)胞會導(dǎo)致該功能運輸系統(tǒng)破壞，mGSH合成減少，進(jìn)而導(dǎo)致ROS積聚，活性氧產(chǎn)生并觸發(fā)抗氧化防御能力失衡從而降低MMP，Hassen等［18］的研究也證實該結(jié)論。另外相關(guān)研究［19-21］表明，無論單一還是聯(lián)合組，通過p53線粒體信號通路，會增加促凋亡因子/抗凋亡因子比來誘導(dǎo)GSH和MMP水平下降。因此，CI模型預(yù)測AFB1+ZEN聯(lián)合作用細(xì)胞，肝毒性呈現(xiàn)協(xié)同聯(lián)合效應(yīng)可能與線粒體損傷和GSH與MMP下降有關(guān)。

基因表達(dá)層面，細(xì)胞P450主要參與體內(nèi)藥物代謝，許多內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化上具有重要作用，真菌毒素通過P450基因家族的調(diào)控來影響其毒性表達(dá)。細(xì)胞暴露于AFB1 3h，CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4基因表達(dá)均受到抑制，這可能由于細(xì)胞關(guān)閉了p450代謝途徑中相關(guān)重要基因表達(dá)通道，但細(xì)胞生存應(yīng)激，又開啟其他補償途徑，使CYP1A2和CYP2A6基因表達(dá)量快速上升，以促進(jìn)細(xì)胞對AFB1的代謝。ZEN處理細(xì)胞，CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4基因表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，直至24 h，這表明細(xì)胞對ZEN的代謝持續(xù)時間較長，24 h可能依然未完成。有研究［22］發(fā)現(xiàn)，P450降低與線粒體氧化損傷有關(guān)，本研究得出CYP1A2等p450基因家族表達(dá)量的變化也與ROS、MMP等亞細(xì)胞早期凋亡指標(biāo)表達(dá)趨勢呈現(xiàn)上述相關(guān)性。

Bax、Caspase-3等是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因［23-24］。其中，Bax基因主要存在于線粒體膜上，為促凋亡因子，主要調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑中外源通路的線粒體通路［25］。外源性通路主要由Caspase家族中的啟動因子來調(diào)控，以線粒體為核心來激活細(xì)胞凋亡，大量的胞內(nèi)信號包括各種應(yīng)激、DNA損失、異常的細(xì)胞信號均可引起促凋亡蛋白Bax的活化，該蛋白誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，形成凋亡小體或活化啟動子。內(nèi)源性和外源性通路最終會激活Caspase家族中的效應(yīng)因子如Caspase-3，從而啟動細(xì)胞凋亡進(jìn)程［26］。結(jié)合Bax表達(dá)結(jié)果分析，AFB1和ZEN造成細(xì)胞凋亡的途徑交叉存在，Bax基因主要參與毒素作用后期。細(xì)胞凋亡途徑十分復(fù)雜且交互作用。線粒體中心磷脂氧化、通透性轉(zhuǎn)換孔開放等是較MMP改變的線粒體損傷更早期指標(biāo)［21］；另外，真菌毒素除引起線粒體損傷外，還可通過其它方式，如脂肪變性、膽汁淤積等誘導(dǎo)肝毒性［27］，因此利用HCA同步監(jiān)測更多毒性早期損傷指標(biāo)具有在聯(lián)合毒性的作用機制解析上具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究利用HCS手段，從基因、亞細(xì)胞二級信使以及細(xì)胞活性等層面對“AFB1+ZEN”單一及聯(lián)合作用于HepG2肝癌細(xì)胞的毒性效應(yīng)和機制進(jìn)行探究。實驗結(jié)果表明，真菌毒素AFB1和ZEN肝毒性機制可能有：一方面利用死亡受體激活凋亡執(zhí)行子caspases-3進(jìn)入凋亡程序；另一方面，毒素刺激誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Bax表達(dá)增加，線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C并激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，最終通過蛋白酶水解而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生早期損傷直至凋亡。多種毒性指標(biāo)及CI模型評估驗證了此兩種毒素對細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用在高劑量水平下多表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，由于該效應(yīng)對風(fēng)險具有放大作用，同時考慮實際毒素大多會以慢性/亞慢性膳食消費模式經(jīng)口暴露，因此為更科學(xué)合理保護(hù)消費者健康安全，在實際農(nóng)產(chǎn)品和食品限量制定和防控監(jiān)管過程中，適當(dāng)考慮該風(fēng)險具有一定意義。