1株產(chǎn)生洛伐他汀雜色曲霉的篩選、鑒定和發(fā)酵優(yōu)化條件

許楚旋 王嘉琦 蔣冬花

（浙江師范大學化學與生命科學學院，金華 321004）

曲霉（Aspergillus spergillus）是最常見且具有重要應(yīng)用價值的絲狀真菌，在自然界的空氣、土壤、水以及作物上都可以發(fā)現(xiàn)其存在，目前已廣泛地應(yīng)用在傳統(tǒng)釀造業(yè)、生物工程研究和現(xiàn)代發(fā)酵等。雜色曲霉（A. versicolor）是世界性廣泛分布種，也是我國最常見的曲霉之一。雜色曲霉（A. versicolor）作為曲霉屬的一種，能產(chǎn)生多種有用的活性代謝產(chǎn)物，分別具有抗?。?］、抗蟲［1］、抗病毒［2］、抗腫瘤［3］、抗氧化［4］、細胞免疫［5］和抗炎癥［6］等多種生物活性。羅寒等［1］從分離自紅樹林植物內(nèi)生真菌的雜色曲霉MA-229的發(fā)酵產(chǎn)物中得到9個化合物，分別對小麥全蝕病菌和小麥赤霉病菌有較好的抑制活性，并且還有抗蟲活性；Yan等［4］從深海中分離到1株雜色曲霉，可產(chǎn)生具有抗氧化活性的胞外多糖體；鞏婷等［6］從海洋真菌雜色曲霉F62中分離得到6個丁內(nèi)酯類活性化合物，均表現(xiàn)出較強的抗炎活性。眾多文獻表明雜色曲霉（A. versicolor）生物活性物質(zhì)非常豐富。

1980年，Alberts等［7］從 土 曲 霉（A. terreus）中提取到稱為洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀類藥物，主要作用機理是該分子酸式結(jié)構(gòu)與羥甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）相似，而HMG-CoA還原酶是合成膽固醇的限速酶，Lovastatin能選擇性的與該限速酶結(jié)合，起到競爭性抑制作用，從而阻斷膽固醇的合成來降低心血管疾病的病發(fā)［8-9］。目前，Lovastatin在食品和藥品工業(yè)中已被廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵工業(yè)中，影響產(chǎn)量的兩個關(guān)鍵因素是生產(chǎn)菌種和發(fā)酵條件。因此，選育穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的曲霉新菌種對并其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，可為Lovastatin工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 曲霉屬菌株 從不同生境（食品、土壤、有機質(zhì)等）收集的自然發(fā)酵樣品，經(jīng)分離篩選得到曲霉屬純菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1） PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15、水、pH 5.5；用于曲霉菌株的分離純化和鑒定。（2）PD培養(yǎng)液（g/L）：馬鈴薯200、葡萄糖20、水、pH 5.5；用于高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選和種子培養(yǎng)。（3）發(fā)酵培養(yǎng)液（g/L）：馬鈴薯200、葡萄糖20、牛肉膏5、水、pH 5.5；用于高產(chǎn)Lovastatin菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。（4）碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5、NaCl 2、KH2PO41、MgSO4·7 H2O 1、水、pH 5.5 ；用于碳源篩選。（5）氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：乳糖20、NaCl 2、KH2PO41、MgSO4·7 H2O 1、水、pH 5.5；用于氮源篩選。

1.2 方法

1.2.1 曲霉菌株的分離純化 從不同生境收集的樣品表面挑取少量菌絲接入PDA平板，28℃培養(yǎng)24 h，白色絨毛狀菌絲長出后，取少許頂端菌絲轉(zhuǎn)接于另一PDA平板上培養(yǎng)3 d，顯微鏡觀察，挑取具有曲霉的典型特征少許頂端菌絲純化3次，得性狀均一的曲霉純菌株。編號保存于25%甘油中，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)生洛伐他汀曲霉菌株的篩選

1.2.2.1 曲霉屬各菌株的培養(yǎng) 保存的菌株在PDA平板上28℃活化培養(yǎng)3 d后，取1菌餅（直徑8mm）接種于PD培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，制得種子液；按8%轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液用于檢測Lovastatin的產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)曲霉菌株。

1.2.2.2 薄層層析法（Thin-layer chromatography，TLC）初篩 發(fā)酵液超聲破壁30 min，取1.5 mL于離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL加100 μL乙酸乙酯振蕩萃取取上層液為待測樣品，毛細吸管吸取1/4管樣品點5次于硅膠板上；Lovastatin標準品為對照，乙酸乙酯作展開劑，展開至15 cm，晾干，紫外燈（波長254 nm）觀察斑點并拍照。

1.2.2.3 高效液相法（High performance liquid chromatography，HPLC）復篩 取發(fā)酵液0.4 mL于2 mL離心管中，加入1.6 mL的甲醇，25 Hz超聲波30 min，50℃水浴2 h，間歇振蕩3-4次，8 000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm有機膜過濾到另一2 mL離心管中，HPLC法測定濾液中的Lovastatin含量。HPLC檢測的色譜條件：Agilent 5 TC-C18（250×4.6 mm）液相色譜柱；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，水為超純水，檢測波長λ = 237 nm，柱溫28℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。Lovastatin標準曲線的繪制參照文獻［10］。

1.2.3 目標菌株的鑒定 目標菌株在PDA平板上28℃培養(yǎng)7 d，顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等的形態(tài)特征。提取目標菌株的基因組DNA，擴增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司測序。根據(jù)形態(tài)特征和rDNA ITS基因序列，參考曲霉屬《The GenusAspergillus》分種檢索表確定所目標菌株屬種。

1.2.4 培養(yǎng)基配方及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 用單因素實驗優(yōu)化培養(yǎng)基配方（碳源種類、氮源種類、碳源含量、氮源含量、碳氮比C/N）和發(fā)酵條件（溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量），實驗設(shè)3次平行重復。數(shù)據(jù)用SPSS軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Dunan’s多重檢驗進行均值比較，顯著性水平設(shè)為P≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同生境分離純化曲霉菌株的形態(tài)特征

經(jīng)分離純化獲得86株曲霉純菌株。不同曲霉菌株的菌落形態(tài)有較大差異（圖1）；分生孢子頭、分生孢子梗、頂囊、分生孢子等顯微形態(tài)特征也各不相同（圖2），表明來源于不同生境的曲霉菌株具有豐富的多樣性。

圖1 5株代表性曲霉菌株的菌落形態(tài)

圖2 5株代表性曲霉菌株的分生孢子頭顯微形態(tài)

2.2 產(chǎn)生Lovastatin曲霉菌株TLC法初篩結(jié)果

通過TLC法初步篩選得到36株產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株。如圖3所示，不同曲霉菌株產(chǎn)生Lovastatin產(chǎn)量不同，有些菌株發(fā)酵液與標準品相同位置條帶明顯，表明該菌株產(chǎn)生Lovastatin含量較高；有些菌株在該位置條帶不明顯或沒有，表明該菌株產(chǎn)生Lovastatin能力較弱或不產(chǎn)生。選取Lovastatin條帶較明顯的菌株進行HPLC法定量檢測復篩。

圖3 Lovastatin標準品和曲霉菌株發(fā)酵液TLC法初篩結(jié)果

2.3 產(chǎn)生Lovastatin曲霉菌株的HPLC法復篩結(jié)果

用HPLC法復篩結(jié)果（圖4）表明不同曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量存在顯著差異。Lovastatin產(chǎn)量大部分分布在10-25 μg/mL之間（34株），25-58 μg/mL范圍內(nèi)有2株曲霉菌株。經(jīng)進一步篩選確證8號曲霉菌株Lovastatin產(chǎn)量最高，為58 μg/mL，并將其編號為A-8。

圖4 Lovastatin標準品和8號曲霉發(fā)酵液HPLC檢測結(jié)果

2.4 A-8曲霉菌株的鑒定結(jié)果

2.4.1 菌落形態(tài)和顯微形態(tài) PDA培養(yǎng)基上的菌落初期為白色絨毛狀或絮狀，后變成灰綠色，邊緣白色，7 d菌落直徑可達50 mm；顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，分支狀；分生孢子頭初為球形，后呈放射形，頂囊呈半橢圓形至半球形；上半部或3/4部位著生小梗，小梗雙層，分生孢子呈淡綠色，球形或近球形，粗糙，直徑（4-5）μm×（4-4.5）μm（圖5）。

圖5 Av-8曲霉菌株P(guān)DA上培養(yǎng)7 d菌落（A）、分生孢子頭（B、C）和分生孢子（D）

2.4.2 rDNA ITS基因序列 A-8曲霉菌株ITS基因序列如圖6，長度為545 bp；系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）分析表明：與雜色曲霉親緣關(guān)系最近，達99%。根據(jù)A-8曲霉菌株的菌落和顯微形態(tài)特征和rDNA ITS基因序列，結(jié)合曲霉屬分種檢索表，鑒定8號菌株為雜色曲霉。

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果見表1。在24-34℃溫度范圍內(nèi)，最適發(fā)酵溫度為28℃；在最適溫度的基礎(chǔ)上，初始pH以 5.2最為適宜；在適宜溫度和初始pH的基礎(chǔ)上，搖床轉(zhuǎn)速以180 r/min為宜；在適宜的培養(yǎng)溫度、pH和搖床轉(zhuǎn)速的基礎(chǔ)上，接種量以10%為宜。

2.6 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

2.6.1 碳源和氮源種類的篩選 碳源和氮源種類的篩選結(jié)果見表2，乳糖為較適宜的碳源，蛋白胨為較適宜的氮源。

2.6.2 乳糖和蛋白胨含量對Lovastatin產(chǎn)量的影響 乳糖和蛋白胨含量對Lovastatin產(chǎn)量的影響結(jié)果見表3。以乳糖為適宜碳源，在70-120 g/L乳糖含量范圍內(nèi)設(shè)置6個梯度；當乳糖含量為100 g/L時，Lovastatin達到最大值為84.33 μg/mL。以蛋白胨為適宜氮源，在4-14 g/L蛋白胨含量范圍內(nèi)設(shè)置6個梯度；當?shù)鞍纂藶?2 g/L時，Lovastatin達到最大值為 87.01 μg/mL。

圖6 A-8曲霉菌株ITS rDNA基因序列（545 bp）

圖7 基于12株曲霉屬ITS rDNA基因序列建立的A-8菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6.3 碳氮比對Lovastatin產(chǎn)量的影響 碳氮比對Lovastatin產(chǎn)量的影響結(jié)果見表4。以乳糖為碳源，蛋白胨為氮源，在碳氮比5/0.5-15/2.25范圍內(nèi)設(shè)置10個梯度；當碳氮比為15/1.5時，Lovastatin達到最大值為 130.04 μg/mL。

3 討論

Alberts等［7，11］報道，紅曲霉及其它一些絲狀真菌如木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）等都會產(chǎn)Lovastatin。其中曲霉屬真菌報道最多，主要種類有費舍爾曲霉（A.fischeri）［12］、黃曲霉（A. flavus）［13］、黃柄曲霉（A.flavipes）［13］、黑曲霉（A. niger）［13］、寄生曲霉（A.parasiticus）［13］，土曲霉（A. terreus）［14］等。目前Lovastatin的主要工業(yè)生產(chǎn)菌種國外為土曲霉（A.terreus）、國內(nèi)為紅曲霉（Monascus）。

表1 發(fā)酵條件對曲霉A-8菌株產(chǎn)Lovastatin的影響

表2 不同碳源和氮源對曲霉A-8菌株產(chǎn)Lovastatin的影響

表3 不同乳糖和蛋白胨含量對曲霉A-8菌株產(chǎn)Lovastatin的影響

表4 碳氮比對曲霉A-8菌株產(chǎn)Lovastatin的影響

已報道的部分曲霉菌株Lovastatin的產(chǎn)量比較見表5。Javed等報道［13］，用黃曲霉（A. flavusGCBL-60）發(fā)酵菌種，米糠為主要原料，在35℃、pH 5.5等條件下，液體發(fā)酵96 h，Lovastatin產(chǎn)量約為28.36 ± 0.76 mg/100 mL。劉愛英等［15］用紫外誘變處理1株紫色紅曲霉（M. purpureusZZ），誘變后搖瓶發(fā)酵該菌株Lovastatin產(chǎn)量為219.9 μg/mL。童振宇等［16］對1株紫色紅曲霉（M. purpureusWX）液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，Lovastatin產(chǎn)量達到了297.4 μg/mL。游玟娟等［17］采用 Box-Behnken 設(shè)計對1株紅曲霉高產(chǎn)突變株（Monascussp. UV-D-9）發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin條件進行了響應(yīng)面優(yōu)化，得到適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度 30.4℃，裝液量為134mL，轉(zhuǎn)速187 r/min，發(fā)酵時間 10 d，接種量8%；Lovastatin產(chǎn)量約為320 mg/L；章婷等［18］篩選到1株產(chǎn)生洛伐他汀棒曲霉（A. clavatus），經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化 Lovastatin產(chǎn)量約為 236 μg/mL；Hasan等［19］通過基因工程手段過表達乙酰輔酶 A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase），使土曲霉（A. terreus）Lovastatin產(chǎn)量提高了40%；Fu等［20］篩選到1株產(chǎn)生洛伐他汀類似物的雜色曲霉（A. versicolorSC0156）。而利用雜色曲霉發(fā)酵產(chǎn)生Lovastatin國內(nèi)外尚未見有報道，本實驗室篩選的曲霉菌株A-8，經(jīng)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件初步優(yōu)化，Lovastatin產(chǎn)量達130 μg/mL左右；通過理化誘變或基因工程改良，Lovastatin產(chǎn)量可進一步提高，本實驗豐富了生產(chǎn)Lovastatin的菌種資源，所選的雜色曲霉菌株具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，來源于不同生境（食品、土壤、空氣和有機質(zhì)等）的曲霉菌株在菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生上具有豐富的多樣性。經(jīng)篩選獲得1株高產(chǎn)Lovastatin曲霉A-8菌株；經(jīng)鑒定A-8菌株為雜色曲霉（A. versicolor）。經(jīng)單因素實驗初步優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基配方，A-8曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)生Lovastatin的水平可達130.04 μg/mL，A-8曲霉菌株是較有潛力的工業(yè)菌株。

表5 已報道的部分曲霉菌株Lovastatin的產(chǎn)量比較