ZIP蛋白在植物中的功能分析

李素貞 陳茹梅

（中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

鋅鐵作為植物營養(yǎng)所必需的微量元素，雖然用量很少，但對于植物的生長和發(fā)育是必不可少的。鐵元素在光合作用、呼吸作用和葉綠素生物合成等反應中起著重要的作用［1］。我國華北平原、黃河故道和西北黃土高原等地，其土壤pH值高達7.5-8.5，并富含游離碳酸鈣，因而缺鐵現(xiàn)象較為嚴重［2］。植物缺鐵表現(xiàn)出葉片變黃，嚴重時會導致其產量和品質的降低。人類缺鐵會出現(xiàn)貧血，嚴重危害孕婦及兒童的健康［3-4］。世界上約三分之一的人群面臨著不同程度的缺鐵所造成的健康問題。鋅是生物體內多種酶的輔助因子［5］，參與機體的各種代謝［6］。石灰性土壤、鹽堿土和砂性土壤有機質含量低、保肥蓄水能力差，所以這幾類土壤嚴重缺鋅［7］。植物缺鋅會導致節(jié)間縮短、葉子向內卷曲及葉片變小等［7］，嚴重缺鋅會導致植物生長受阻進而影響植物的產量和品質。人類缺鋅會導致生長發(fā)育緩慢、智力發(fā)育低下、營養(yǎng)不良等［8］。世界約17.3%的人口面臨著鋅吸收不足的威脅［9］。鋅鐵對于植物的生長及提高谷物的產量是至關重要的，人們依賴從植物中獲得日常膳食所需的鋅鐵。所以，增加植物獲得鋅鐵的能力，對植物的生長發(fā)育和人類的健康具有重要的意義。為實現(xiàn)這一目的，揭示植物應答及獲得鋅鐵的機制是至關重要的。鋅鐵轉運蛋白（Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like protein，ZIP）家族蛋白在鋅鐵吸收和轉運中有重要作用。ZIP家族蛋白一般由309-476個氨基酸組成，絕大部分成員具有8個跨膜結構域及相似的拓撲結構。第III、IV跨膜區(qū)之間有一長的可變區(qū)，可變區(qū)位于胞內，其C、N末端位于胞外，該區(qū)富含組氨酸殘基，可能與二價金屬離子的結合、轉運有關［10］。ZIP通過將二價金屬離子吸收轉運至細胞質保持體內離子的平衡。表1為近年來已經在擬南芥、水稻及其它植物中開展的一些相關基因功能的研究工作。

1 ZIP家族基因在植物中的研究

1.1 擬南芥中ZIPs家族基因的研究

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有16個ZIP基因，AtIRT1是首先被鑒定的基因，主要在擬南芥的根中表達，AtIRT1能夠互補酵母鐵突變體的功能。AtIRT1是鐵轉運體，irt1突變體導致葉片黃化致死表型，并且表現(xiàn)出明顯的發(fā)育缺陷，包括減少了葉綠體類囊體在基粒中的疊加，影響葉片柵欄薄壁細胞的分化，莖中維管束數目的減少以及根的皮層及內皮層細胞排列不規(guī)則等。并且irt1突變體導致鐵在莖葉的積累減少。irt1突變體應答缺鋅及缺鐵是通過激活ZIP1在莖葉的表達，降低ZIP2及增強IRT2在根部的表達來保持體內鋅鐵平衡的［11］。以上結果說明AtIRT1對于植物的正常發(fā)育以及體內鋅鐵平衡的調節(jié)是必需的。35S（The cauli fl ower mosaic virus 35S promoter）啟動AtIRT1的過表達植株中，mRNA在整個植物體內均有表達，而其蛋白只在缺鐵的根中檢測到，說明AtIRT1是受轉錄后調節(jié)的［12］。高鎳誘導AtIRT1的表達，缺鐵條件下，AtIRT1能夠導致鎳的含量在擬南芥中積累，說明鎳的積累是由于AtIRT1在鐵的吸收過程中導致的結果［13］。AtIRT2是與AtIRT1高度相似的鐵轉運體，能夠恢復鐵缺陷突變體的轉運活性。其主要在根中表達，受缺鐵誘導，并且IRT2啟動子與報告基因的融合實驗證明AtIRT2主要在根頂端的外層細胞表達，說明AtIRT2在缺鐵條件下能夠從土壤中吸收鋅與鐵［14］。之后的研究證明AtIRT2定位于囊泡，其可能通過對鐵的區(qū)室化起到解毒的作用［15］。AtIRT3能夠互補鋅缺陷突變體的轉運活性，其蛋白定位于質膜。過表達AtIRT3能夠使莖葉鋅的含量增加，根中鐵的含量增加。證明AtIRT3具有鋅鐵轉運功能［16］。

AtZIP1-AtZIP5、AtZIP9-AtZIP12及AtIRT3受缺鋅誘導，所以這些基因可能對于鋅的吸收有作用［17］。有研究證明AtZIP1-AtZIP3在酵母中具有鋅的吸收活性，AtZIP1與AtZIP3在缺鋅的根中表達，推測其可能具有從土壤中吸收鋅的功能。AtZIP2的表達在根中未檢測到，而AtZIP4在缺鋅的根及莖葉均有表達，所以AtZIP4可能在細胞內或者植物組織間轉運鋅［18］。利用Ubiquitin啟動子驅動AtZIP1在大麥中過表達，在短期缺鋅條件下過表達植株種子中鋅含量是增加的，如果在正常條件及長時間缺鋅條件下，轉基因植株葉片及莖中鋅的含量及生物量與野生型相比無明顯變化。但在缺鋅條件下，AtZIP1轉基因植株從根向莖葉的轉運效率比野生型升高，所以土壤條件會影響轉基因植物對鋅的獲得［19］。AtZIP1及AtZIP2能互補鋅與銅的酵母突變體活性，推測其吸收鋅及銅。AtZIP1及AtAIP2均在根的中柱表達，AtZIP1也在葉的維管束表達，且其蛋白定位至液泡膜，而AtZIP2定位于質膜。T-DNA插入突變體進行功能研究，說明AtZIP1及AtZIP2從根向莖葉轉運銅（可能轉運鋅）。AtZIP1可能具有將銅從液泡轉運至中柱細胞，進而運至木質部薄壁細胞的功能；AtZIP2可能具有將銅（或鋅）吸收至根的中柱細胞，進而轉運至木質部薄壁細胞的功能［20］。

1.2 水稻中ZIPs家族基因的研究

ZIP家族基因在水稻（Oryza sativaL.）中也有研究，目前已知水稻ZIP基因家族包含16個成員。OsIRT1與OsIRT2是水稻中的兩個鐵轉運體，其主要在根中受缺鐵誘導表達。在酵母中其能互補鐵突變體的轉運活性［21］。在水稻中過表達OsIRT1可增強植物對缺鐵的耐受力，并且植物的株型發(fā)生變化，在生殖生長階段轉基因植株與野生型相比株高降低、分蘗數減少。此外，轉基因植物對高鋅與高鎘比較

敏感，說明OsIRT1也轉運鋅和鎘。過表達OsIRT1可使水稻的根、莖、葉和成熟種子中鋅鐵的含量提高，說明OsIRT1可用于強化谷物中的鋅鐵含量［22］。在缺鋅條件下，OsZIP1與OsZIP3在根和莖葉中的表達量均升高，而OsZIP2的表達量主要在根中升高；原位雜交實驗證明，OsZIP1和OsZIP3主要在莖葉的維管束、根的維管束和韌皮部細胞表達［23］。后續(xù)研究表明oszip3突變體與野生型之間鋅的含量有顯著差異，突變體地上部（不包括基部）鋅的含量升高，地上基部區(qū)域鋅的含量下降。通過同位素標記67Zn示蹤，發(fā)現(xiàn)突變體中鋅的含量在下部葉片中較高，在地上部伸長區(qū)和節(jié)點處含量較少，表明OsZIP3負責將鋅從木質部卸載并優(yōu)先分配到正在生長發(fā)育的組織中［24-25］。OsZIP4主要在缺鋅的根與莖葉中表達，在缺鋅條件下，OsZIP4的轉錄水平在根和莖葉中均比OsZIP1和OsZIP3高。此外，OsZIP4能夠互補鋅突變的轉運活性，說明OsZIP4是鋅轉運體。OsZIP4-GFP定位于洋蔥表皮的質膜，原位雜交實驗證明，其在缺鋅條件下的根與莖葉的韌皮部和分生組織中表達，推測OsZIP4可能負責鋅在水稻中的轉運［26］。利用35S啟動子啟動OsZIP4在水稻中過表達，結果發(fā)現(xiàn)轉基因水稻根中鋅的含量比野生型升高約100倍，而莖葉及種子中鋅的含量分別降低了5倍和4倍。Northern及實時定量PCR證明35S啟動的OsZIP4在根及莖葉中均有表達，而內源的OsZIP4在根中的表達量降低，在莖葉中的表達量升高。這些結果表明過表達OsZIP4改變了鋅在水稻中的分布，并且需要嚴格調節(jié)OsZIP4的表達來保持體內鋅的平衡［27］。在缺鋅、缺鐵和缺錳誘導時，OsZIP6在地上部表達水平升高3倍，但只有缺鐵條件下根中OsZIP6表達量才能夠升高3倍［28］。OsZIP7a在缺鐵的根中表達，而OsZIP8在缺鋅的根及莖葉均有表達；OsZIP7a與OsZIP8分別互補酵母缺鐵及缺鋅突變體活性。說明OsZIP7a與OsZIP8分別是鐵與鋅的轉運體［29］。OsZIP5與OsZIP8是缺鋅誘導的基因，能夠互補酵母鋅突變體的轉運活性，其蛋白均定位于質膜。過表達OsZIP5及OsZIP8使水稻根中的鋅含量增加，而莖葉中鋅的含量減少。結果說明OsZIP5與OsZIP8是鋅轉運體，并且對鋅在水稻中的分布有重要作用［30-31］。OsZIP9與OsZIP5是高度相似的蛋白，OsZIP9也受缺鋅誘導，并且能互補OsZIP5的功能［30］。說明OsZIP9與OsZIP5是水稻中具有相似的功能鋅轉運體。

表1 已知ZIPs家族成員及功能

1.3 大麥中ZIPs家族基因的研究

大麥（Hordeum vulgare）中共鑒定了13個ZIP基因，HvIRT1與水稻OsIRT1同源，其在酵母中轉運鋅、鐵、錳及鎘。HvIRT1受缺鐵、缺錳誘導，其蛋白定位于質膜。HvIRT1的表達與錳的吸收效率是一致的，說明HvIRT1對于錳在大麥根中的吸收有重要作用［32］。隨后通過酵母互補實驗證明了大麥中的3個鋅轉運體HvZIP3、HvZIP5和HvZIP8。HvZIP8在大麥的根中表達，而HvZIP3與HvZIP5在缺鋅的根中表達。這些結果說明HvZIP3、HvZIP5和HvZIP8是在大麥根中參與鋅平衡的轉運體［33］。HvZIP7在根及莖葉中均受缺鋅誘導，其蛋白定位于質膜。過表達HvZIP7在高鋅條件下莖葉鋅的積累升高，其它離子鐵、錳、銅、鎘均無明顯變化。說明HvZIP7是有功能的鋅轉運體［34］。后續(xù)研究對大麥中的13個ZIPs基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)HvZIP3、HvZIP7、HvZIP8、HvZIP10、HvZIP13與HvZIP5在根中表達，在缺鋅條件下基因表達量是有鋅條件下的3倍，并且在莖葉中升高14倍。而HvZIP2的表達在缺鋅的根中升高1.5倍，在莖葉中升高5倍。再重新提供有鋅的條件，以上7個基因在莖葉中的表達量與缺鋅條件下無明顯差異，比在最初有鋅的條件下表達量略有降低。重新提供鋅，HvZIP2與HvZIP10在根中的表達量比缺鋅條件有所降低，而其它5個基因在根中的表達量升高。HvIRT1、HvZIP1、HvZIP11、HvZIP14、HvZIP16與HvZIP6不受缺鋅誘導，再重新提供鋅時基因表達也無明顯變化。HvZIP3、HvZIP5、HvZIP7、HvZIP8、HvZIP10和HvZIP13蛋白均定位于質膜。以上結果說明HvZIP3、HvZIP5、HvZIP7、HvZIP8和HvZIP-13這5個HvZIPs基因對于將鋅吸收至根并轉運至莖葉中有重要作用（重新提供鋅的條件下）［35］。

1.4 蒺藜苜蓿中ZIPs家族基因的研究

在苜蓿（Medicago truncatula）中共鑒定了7個ZIP基因，首先報道的ZIP基因是MtZIP2，其在酵母中能轉運鋅，MtZIP2蛋白定位于質膜，在苜蓿的根與莖中表達。不像其它ZIP一樣，MtZIP2是高鋅誘導的轉運體。說明MtZIP2可能對于鋅的解毒有作用［36］。后來鑒定了 MtZIP1、MtZIP3、MtZIP4、MtZIP5、MtZIP6和 MtZIP7共 6個 MtZIPs蛋 白，MtZIP1、MtZIP5和MtZIP6能恢復酵母鋅缺陷突變體的轉運活性，MtZIP4和MtZIP7能恢復酵母錳缺陷突變體的轉運活性，MtZIP3、MtZIP5和MtZIP6能恢復酵母鐵缺陷突變體的轉運活性。表達分析發(fā)現(xiàn)，MtZIP1在缺鋅苜蓿的根及葉中均有表達；MtZIP3與MtZIP4在缺鐵的葉片中表達量下降，而在缺鋅的根及葉中表達上調；MtZIP5在缺鋅及缺錳的葉片中表達量升高；MtZIP6與MtZIP7的表達不受金屬離子濃度的影響。以上結果說明MtZIPs具有不同的離子選擇性，并且對植物體內金屬離子的調節(jié)及保持金屬離子的平衡具有不同的作用［37］。進一步研究表明MtZIP1對鋅的親和力比MtZIP5與MtZIP6 低［38］。

1.5 玉米中ZIPs家族基因的研究

本實驗室在玉米（Zea maysL.）中共鑒定了9個ZmZIPs基因，分別將玉米中的9個ZIP基因命名為ZmZIP1-8及ZmIRT1。前期的工作對玉米幼苗、授粉后不同天數的胚和胚乳進行了Real-time RT-PCR表達分析。結果顯示，ZmIRT1在缺鐵玉米的根和莖葉中表達均上調，ZmZIP4、ZmZIP5、ZmZIP7、ZmZIP8在高鐵處理條件下表達上調。這些結果說明ZmIRT1可能對鋅和鐵的吸收起著一定的作用，ZmZIP4、ZmZIP5、ZmZIP7及ZmZIP8可能與鐵的儲存和解毒有關。ZmZIP4主要在胚中表達，ZmZIP5在胚和胚乳中均有表達，推測ZmZIP4和ZmZIP5可能對胚根和胚芽的生長有重要作用。然而，ZmIRT1和ZmZIP6在胚發(fā)育的后期表達量上調，推測ZmIRT1和ZmZIP6可能與胚的成熟有關。這些結果說明ZmIRT1、ZmZIP4、ZmZIP5和ZmZIP6可能在胚和胚乳的發(fā)育過程中具有非常重要的作用，推測它們與籽粒中鋅或鐵的積累有關。ZmZIPs-GFP融合蛋白定位于質膜與內質網，推測ZmZIPs可能在植物細胞中起吸收、轉運和儲存鋅鐵的作用，也可能參與鋅鐵離子的解毒。酵母互補實驗顯示ZmIRT1在低鋅和低鐵條件下分別能顯著地互補fet3fet4DEY1453和zrt1zrt2ZHY3突變體的功能，其它基因表現(xiàn)出不同程度的互補功能。證實了ZmZIPs可能在鋅鐵吸收及轉運過程中起主要作用［39］。后續(xù)研究中，將ZmIRT1、ZmZIP3及ZmZIP7在擬南芥中過表達。ZmIRT1能夠增加擬南芥根及種子中的鋅鐵含量，ZmZIP3將較多的鋅聚集于根中，ZmZIP7使鋅鐵在根中積累及鐵在種子中積累。ZmIRT1及ZmZIP7的過表達激活了擬南芥中鐵吸收及轉運相關基因的表達，而ZmZIP3過表達抑制了鐵吸收及轉運相關基因的表達。以上結果說明，ZmZIPs在保持體內鋅鐵平衡中具有不同的作用［40-41］。

1.6 其它植物中ZIPs基因的研究

番茄（Lycopersicon esculentum）中鑒定了LeIRT1與LeIRT2兩個基因，其主要在番茄的根中表達，LeIRT2的表達水平不受鐵離子水平的影響，而LeIRT1受缺鐵誘導。酵母互補實驗證明LeIRT1與LeIRT2均能互補鐵缺陷突變體的轉運活性，并且也能互補鋅、銅與錳缺陷突變體的轉運活性，說明LeIRT1與LeIRT2能夠轉運多種金屬離子［42］。在大豆中分離了一個ZIP基因GmZIP1，Nothern分析發(fā)現(xiàn)GmZIP1在缺鋅23 d的大豆根、莖及葉片中沒有表達，但是在根瘤中有表達，并且隨著缺鋅天數的增加其在根瘤中的表達量逐漸升高。推測大豆GmZIP1可能在大豆與根瘤菌的共生關系中發(fā)揮作用［43］。葡萄（Vitis viniferaL.）中的VvZIP3主要在生殖器官尤其在發(fā)育的花中表達，能恢復缺鋅酵母突變體的轉運活性，其蛋白定位于質膜。并且鋅在葡萄各個組織中的積累與其表達量呈正相關，說明VvZIP3是有功能的鋅轉運體［44］。蘋果（Malus xiaojinensis）中的MxIRT1是鐵轉運體，在水稻中過表達MxIRT1能夠增加水稻對缺鋅、缺鐵的耐受性，并且能夠增加水稻種子中的鋅鐵含量，但是鎘的含量降低。說明MxIRT1是生物強化籽粒中鋅鐵含量比較好的基因［45］。野生二粒小麥（Triticum turgidum）中克隆的TdZIP1為缺鋅誘導的鋅轉運體，其定位在內質網，過表達TdZIP1導致鋅在細胞內的積累對細胞產生毒性［46］。說明鋅鐵的平衡必須嚴格的調節(jié)才能保證植物的正常生長發(fā)育。

2 結語

通過對多種植物中ZIP的研究表明，不同ZIP基因在植物中的表達部位、蛋白的亞細胞定位、對于二價金屬離子的選擇性以及各基因在植物吸收、轉運及儲存鋅鐵中的功能是有區(qū)別的。因此，對ZIP在植物中不同功能的了解，有助于根據不同需求選擇基因進行有效利用。例如，利用ZIP和其它有利于鋅鐵在種子中富集的基因，增加籽粒中的鋅鐵含量，直接或間接緩解人類攝入鋅鐵不足的狀況；利用將鋅鐵聚集于莖稈及葉片中的基因在植物中過表達增加地上部組織中的鋅鐵含量，飼喂牲畜滿足其對微量元素的需求；對該家族中吸收儲存重金屬鎘的基因加以改造，使其特異地將鎘聚集于植物中，從而減輕土壤中重金屬的污染，是通過生物對土壤進行修復和改良的重要發(fā)展方向。