黑柴胡提取物對老年癡呆小鼠模型認(rèn)知功能和腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的作用研究*

李 娟，姚 遙，洪 洲，李 南，鄭 萍，趙啟躍

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(銀川 750004)，2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(銀川 750004)，3. 延安大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科(延安 716000)

主題詞 黑柴胡 老年癡呆 認(rèn)知功能 神經(jīng)炎癥

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床主要特征包括記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格和行為改變等[1-2]。AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近年來越來越多的研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化誘發(fā)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD的主要病因之一[3]。中藥黑柴胡為傘形科柴胡屬植物黑柴胡或小葉黑柴胡的干燥根，主要分布于內(nèi)蒙、甘肅、青海等地區(qū)，在我國西北地區(qū)常用作柴胡的代用品。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，黑柴胡中主要含有黃酮、皂苷類、木脂素、多糖及甾醇等類型化合物，具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、保肝等藥理活性。其中，黑柴胡的抗炎作用尤為突出，有研究表明，黑柴胡和北柴胡的水煎液均能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳殼腫脹，且二者的抗炎作用沒有顯著性差異[5]?；谏窠?jīng)炎癥在AD發(fā)病中的重要作用，我們推測具有顯著抗炎效果的黑柴胡可能對AD有治療作用。因此，本文通過側(cè)腦室注射LPS建立神經(jīng)炎癥AD小鼠模型，考察黑柴胡提取物對AD小鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)神經(jīng)炎癥的作用，以期為黑柴胡的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物 黑柴胡于2016年3月購自亳州藥材市場，經(jīng)寧夏藥品檢驗(yàn)所韓文欣主任藥師鑒定為柴胡屬植物黑柴胡(Bupleurum smithii Wolff)的干燥根。制備方法：將黑柴胡粉碎至粗粉狀，按照料液比1：8加入75%乙醇，在75℃下回流提取3次，每次1 h，濾液合并后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至適宜體積，隨后轉(zhuǎn)至鼓風(fēng)干燥箱中干燥至浸膏狀，即得黑柴胡提取物(Extract of bupleurum smithii wolff, EOB)，給藥時(shí)按照提取率換算成原藥材量(1 g/kg劑量即為每公斤體重給藥1g生藥量)。脂多糖，用生理鹽水配成5 μg/μL的溶液，臨用前配制；鹽酸多奈哌齊(批號20160510)，臨用前研磨均勻并用生理鹽水配成0.5 mg/mL的溶液；TNF-α、IL-1β試劑盒；其余常規(guī)試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性ICR小鼠72只，體質(zhì)量20～22 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(寧)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：動物同室分籠飼養(yǎng)，使用普通鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20℃～25℃，濕度40%～60%。

3 實(shí)驗(yàn)儀器 RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHB-B95A型真空泵；DHG-9140型鼓風(fēng)干燥箱；WMT-100型Morris水迷宮系統(tǒng)；BW-NOD405型新物體識別實(shí)驗(yàn)箱；Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 分組、造模與給藥:72只ICR隨機(jī)分為空白組、模型組、EOB低、中、高劑量組，陽性對照組，每組12只?？瞻捉M小鼠側(cè)腦室注射生理鹽水(3 μL/只)，模型組和藥物治療各組小鼠側(cè)腦室注射等體積的LPS溶液(5 μg/μL，3 μL/只)建立AD模型。參照小鼠腦立體定位圖譜，側(cè)腦室注射位置在兩眼連線中點(diǎn)偏右1 mm和后眼角連線后2 mm處，顱骨表面皮膚消毒處理后，將微量注射器垂直刺入顱骨表面2 mm，將LPS溶液注入側(cè)腦室，留針3 min后取出[6]。造模后次日起，EOB低、中、高劑量組每天灌胃EOB 1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg，陽性對照組小鼠每天灌胃多奈哌齊5 mg/kg，空白組、假手術(shù)組和模型組每天灌胃給予相同體積的生理鹽水，均為1次/d，連續(xù)灌胃21 d。

4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：小鼠造模后14～17 d進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]。每天進(jìn)行1次測試，連續(xù)測試3 d。水迷宮實(shí)驗(yàn)在直徑120 cm、高50 cm的水池中進(jìn)行。在水池上4個(gè)象限，每象限邊緣的中心作水池的入水點(diǎn)。在第四象限的中心放入一圓平臺，平臺直徑6 cm、高30 cm。實(shí)驗(yàn)前加水至水面高于平臺1～2 cm，用染料將水染黑，控制水溫在(21±1)℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠依次從1-3象限面向水池壁放入水池中，讓小鼠自由游泳尋找平臺，同時(shí)記錄小鼠找到平臺所需的時(shí)間，即逃避潛伏期。小鼠爬上平臺后，讓小鼠在平臺上停留30 s。若在60 s內(nèi)未能找到平臺，則人為將小鼠放置于平臺上停留30 s。實(shí)驗(yàn)時(shí)保持環(huán)境安靜，以減少外界干擾因素引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

4.3 新物體識別實(shí)驗(yàn)：嚙齒類動物對新物體都有一定的探索本性，而認(rèn)知功能損傷的動物對新物體的辨別能力下降，新物體識別實(shí)驗(yàn)正是利用這種特點(diǎn)設(shè)計(jì)的[8]。該實(shí)驗(yàn)在造模后第18～20天進(jìn)行，用于評價(jià)動物對新物體的識別能力。實(shí)驗(yàn)在一方形白色不透明有機(jī)玻璃測試箱(50 cm × 50 cm × 30 cm)中進(jìn)行，箱體上方放置攝像機(jī)，使用MGS-1分析軟件跟蹤記錄動物的運(yùn)動。整個(gè)測試為期3 d，分適應(yīng)期、訓(xùn)練期和檢測期。適應(yīng)期將小鼠放入測試箱，讓其自由活動3 min適應(yīng)環(huán)境，然后將小鼠放回原來的飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練期在測試箱中對稱放入2個(gè)相同(形態(tài)，大小，規(guī)格一樣)的物體(A1和A2)，測試物距測試箱壁約10 cm，彼此相距約25 cm。將小鼠從距離兩個(gè)物體等距離處放入箱中自由探索3 min，如果小鼠的鼻子觸及測試物或用鼻子在1 cm之內(nèi)指向物體則被視為發(fā)生探索行為，記錄小鼠在此階段對兩個(gè)測試物的總探索時(shí)間。5 min后進(jìn)入檢測期，用物體B(形狀、大小、顏色與A完全不一樣)替換物體A2，分別記錄小鼠對新測試物和熟悉測試物的探索時(shí)間，計(jì)算新物體偏愛指數(shù)(新物體偏愛指數(shù)=小鼠對新測試物的探索時(shí)間/小鼠對熟悉測試物和新測試物的總探索時(shí)間)。測試結(jié)束后，用75%乙醇擦拭測試箱，以防止動物氣味殘留影響實(shí)驗(yàn)。

4.4 ELISA實(shí)驗(yàn)：造模后第21天，最后一次灌胃給藥1 h后，將小鼠快速斷頭處死，取大腦海馬組織配制成10%腦海馬勻漿。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測腦海馬勻漿中TNF-α、IL-1β和ROS的含量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較用Oneway ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EOB對AD小鼠NOR實(shí)驗(yàn)新物體偏愛指數(shù)的影響 如表1所示，側(cè)腦室注射LPS后，模型組小鼠的新物體偏愛指數(shù)較空白組顯著降低 (P< 0.01)；EOB高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠的新物體偏愛指數(shù)均明顯高于模型組(P< 0.05或P< 0.01)，表明黑柴胡提取物能夠明顯改善AD小鼠的新物體識別能力。

表1 黑柴胡提取物對AD小鼠NOR實(shí)驗(yàn)新物體偏愛指數(shù)的影響

注：與空白組相比△P<0.01; 與模型組相比，*P< 0.05, ▲P< 0.01

2 水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響 如表2所示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組小鼠的逃避潛伏期均有逐漸縮短的趨勢。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠第2～4天的逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)。與模型組相比，EOB低劑量組動物的逃避潛伏期有所減短，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；EOB中劑量組第3～4天逃避潛伏期與模型組相比明顯縮短(P<0.05)；而EOB高劑量組則從第2天開始逃避潛伏期即短于模型組(P<0.05)，結(jié)果表明黑柴胡提取物對LPS誘導(dǎo)的AD小鼠空間記憶損傷有明顯改善作用。

3 EOB對AD小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和ROS含量的影響 如表3所示，與空白組相比，模型組小鼠腦內(nèi)海馬組織中TNF-α、IL-1β和ROS含量顯著升高 (P< 0.01)；與模型組相比，不同劑量的EOB和陽性對照藥多奈哌齊均可明顯降低海馬區(qū)TNF-α、IL-1β和ROS含量 (P< 0.05)；表明黑柴胡提取物可抑制LPS誘導(dǎo)的AD小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)炎癥因子的釋放。

表2 黑柴胡提取物對AD小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響

注：與空白組相比，#P<0.05,△P<0.01;與模型組相比，*P<0.05

表3 EOB對AD小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和ROS含量的影響

注：與空白組相比，△P<0.01; 與模型組相比*P<0.05, ▲P<0.01

討 論

AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主流的學(xué)說主要有Aβ沉積，Tau蛋白過度磷酸化、膽堿能系統(tǒng)障礙、慢性神經(jīng)炎癥等[9-10]。本研究主要從神經(jīng)炎癥角度，研究抗炎中藥黑柴胡對LPS側(cè)腦室注射誘導(dǎo)的AD模型小鼠的治療作用。

LPS是經(jīng)典的神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)藥物，通過側(cè)腦室注射LPS可引起一系列炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IL-1β、TNF-α、ROS等炎癥因子的釋放，引起實(shí)驗(yàn)動物認(rèn)知損傷。據(jù)此我們通過側(cè)腦室注射LPS建立了AD神經(jīng)炎癥模型。本研究結(jié)果顯示，EOB給藥后可使小鼠逃避潛伏期明顯縮短，新物體偏愛指數(shù)明顯升高，提示黑柴胡提取物對LPS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動物學(xué)習(xí)記憶功能損傷有明顯的保護(hù)作用。TNF-α、IL-1β和ROS炎癥細(xì)胞因子在AD發(fā)病過程中扮演了重要角色，它們一方面可以直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和死亡，另一方面可以誘發(fā)神經(jīng)元毒性級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Aβ沉積，加劇活化的小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)的免疫反應(yīng)，加快AD的病理進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，黑柴胡提取物可降低小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和ROS的含量，對神經(jīng)炎癥具有抑制作用。

綜上所述，EOB能夠明顯緩解LPS誘導(dǎo)的AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷，這一作用可能與其能夠抑制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。結(jié)果表明黑柴胡是一種有開發(fā)前景的抗AD中藥，其活性成分和作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。