破血化瘀湯治療急性腦內(nèi)血腫大鼠療效及其對VEGF、GAP-43影響的研究*

周漢光，張建黨，張?jiān)澹馨⒌?/p>

1.河南省南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科(南陽 473000)，2.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科 (洛陽 471000)

主題詞 血腫 @破血化瘀湯 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

隨著社會(huì)水平的提高和交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，外傷造成的顱腦損傷發(fā)生率僅次于四肢傷，在全身損傷中高達(dá)15%，其中以腦內(nèi)血腫最為常見[1-2]。急性腦內(nèi)血腫是指腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的血腫，可發(fā)生在腦組織的任何部位，好發(fā)于額葉及顳葉前端，占總數(shù)的80%，其次是頂葉和枕葉約占10%左右，其余則分別位于腦深部、腦基底節(jié)、腦干及小腦內(nèi)等處[3-5]。顱腦損傷后，血腫迅速形成，隨著出血繼續(xù)，血腫不斷擴(kuò)大，進(jìn)而推移、壓迫腦組織，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高和腦疝形成，從而引發(fā)一系列臨床癥狀[6]。該病具有損傷部位嚴(yán)重、發(fā)病迅速、預(yù)后不良的特點(diǎn)。西醫(yī)對腦出血的治療主要采取保守的內(nèi)科治療，如脫水降顱內(nèi)壓，控制水腫，調(diào)整血壓等，大劑量出血采取手術(shù)消除血腫，而中醫(yī)藥對本病在預(yù)防治療和康復(fù)方面有良好的療效與優(yōu)勢。中醫(yī)理論中提出“離經(jīng)之血便是瘀”一說，所以對急性腦出血提出了破血化瘀的治療法則，臨床上取得了較好的療效，但是對其作用機(jī)制的研究尚缺乏理論支持，有必要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的刺激血管生成的因子之一，腦出血后血管再生是其治療的關(guān)鍵所在，而VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子，其在急性腦出血恢復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[7]。生長相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)對神經(jīng)的生長、發(fā)育、再生及突觸功能的維持和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程中發(fā)揮著重要的作用，是神經(jīng)再塑、再生的分子標(biāo)志物[8]。本實(shí)驗(yàn)主要是觀察以破血化瘀的中藥湯劑對急性腦內(nèi)血腫大鼠的治療效果及其對VEGF和GAP-43表達(dá)的影響。

材料與方法

1 材 料

1.2 試 劑：人VEGF ELSIA試劑盒；Re-vertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒；GIBCOTM M199培養(yǎng)基干粉，引物;AEC顯色試劑盒；Ultra Sensitive TM S-P試劑盒; Boyden小室;鼠抗人VEGF、兔抗人VEG-FR2、AEC水性封片劑；recom-binant Taq酶(1U/μl)，dNTPs(10 mmol/L);3%戊巴比妥鈉，4%多聚甲醛溶液，明膠，10%水合氯醛。

1.3 設(shè) 備：顯微鏡(日本，Olympus公司); 顯微圖像分析Motic Images 2000 1.3、數(shù)碼成像系統(tǒng); 凝膠成像系統(tǒng)及配套軟件 Quantity One(美國，BIO-RAD公司)；PE9600基因擴(kuò)增儀(美國，PE公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國，BioTek公司);電泳儀(美國，BIO-RAD公司)；電冰箱。其他使用器械:靜脈留置套管針、棉簽、棉球、醫(yī)用膠布、一次性醫(yī)用橡膠手套、止血鉗、彎鉤鉗、醫(yī)用手術(shù)縫合針、玻璃分針、持針器、眼科剪、器械盤、手術(shù)刀、手術(shù)縫合線等。

1.4 動(dòng) 物：SD大鼠，6周齡，體重(150±20) g，雌雄各半，SPF級，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥：采用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠，隨機(jī)分為破血化瘀湯組和空白對照組，每組20只。兩組以7 d連續(xù)灌胃給藥形式，一組以15 g/kg破血化瘀湯劑量，另一組則給予等量生理鹽水，2次/d，共14次，第8天注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，靜置、離心、滅活處理之后，分離血清，收集上層血漿，低溫保存。

2.2 ELSIA檢測VEGF含量：依照人VEGF ELSIA試劑盒說明書，吸取各組經(jīng)藥物處理48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行檢測。

2.3 免疫組化及PCR檢測VEGF含量：將2 ml細(xì)胞懸液接種在置于10 cm2培養(yǎng)皿經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片，取出經(jīng)48 h后藥物處理的蓋玻片，經(jīng)過磷酸緩沖液(PBS)清洗，固定10 min的中性甲醛，經(jīng)過透膜處理20 min以后，采用常規(guī)免疫組化對照檢測VEGF，選鼠抗人VEGF單克隆抗體為一抗，另一抗以PBS作陰性對照。應(yīng)用Motic Images 2000 1.3采集圖像及顯微圖像對VEGF免疫組化圖片進(jìn)行對照分析，蛋白的相對含量則采用平均灰度值來間接表示，與陽性反應(yīng)產(chǎn)物成相反趨勢，蛋白含量越少，陽性反應(yīng)產(chǎn)物越深，平均灰度值越小。分別對5 d、10 d、15 d的各組大鼠進(jìn)行免疫組織染色，經(jīng)10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔注射、麻醉，灌注破血化瘀湯劑，取腦組織。用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟制作石蠟切片染色，將明顯血腫切片選出，留用分析。對選出的切片進(jìn)行室溫脫蠟，在3% H2O2溶液中靜置10 min，經(jīng)過蒸餾水和磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min，再將切片浸于枸椽酸鹽緩沖液(PH6)中，每隔10 min后微波修復(fù) 5 min。自然冷卻至室溫后，滴加一抗(GAP-43)，于4℃冰箱孵育12 h。切片由磷酸緩沖液(PBS)沖洗6 min，甩干后滴加相應(yīng)二抗，于恒溫箱(37℃)中孵育30 min，PBS再?zèng)_洗6 min。二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色5～10 min，注意控制染色深度，沖洗后，蘇木素復(fù)染1～2 min，再?zèng)_洗，脫水封片。隨機(jī)選取各時(shí)間點(diǎn)每組各標(biāo)本于血腫區(qū)周圍6個(gè)視野，采用高倍鏡( ×400)進(jìn)行觀察， 再利用Motic 3000數(shù)碼成像系統(tǒng)，計(jì)算平均每個(gè)視野內(nèi)GAP-43的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。每組GAP-43陽性蛋白細(xì)胞數(shù)以120個(gè)視野的平均值。

2.4 治療效果評價(jià)：分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照對比，觀察不同濃度的破血化瘀湯劑較同血清含量的空白對照組對VEGF水平的影響、對VEGF表達(dá)的影響、VEGF受體的影響；觀察造模后的第5天、第10天、第15天破血化瘀湯組與空白組相比對大鼠腦組織GAP-43蛋白表達(dá)的影響。

結(jié) 果

1 破血化瘀湯劑對VEGF水平的影響 分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照組對比，從VEGF ELISA 檢測結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，2.5%含藥血清與2.5%空白對照組相比能顯著提高血管內(nèi)皮生長因子VEGF的含量(P<0.05)，說明該濃度的含藥血清能夠顯著促進(jìn)VEGF的分泌;而其余濃度的含藥血清對VEGF的作用不是十分顯著。

2 破血化瘀湯劑對VEGF表達(dá)的影響 Motic 3000處理免疫組化照片的圖像分析結(jié)果(圖1)顯示，與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清組的VEGF灰度值最小，表明該組細(xì)胞內(nèi)VEGF相對含量最高，同時(shí)也能顯著促進(jìn)VEGF的合成(P<0.05)，另外兩種藥物濃度對VEGF的含量水平與合成均無顯著影響。

3 破血化瘀湯劑對VEGF受體的影響 RT-PCR的檢測結(jié)果(表2，圖1)顯示，分別將3種不同濃度的破血化瘀湯劑組與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清與2.5%的空白對照組相比，血管內(nèi)皮生長因子VEGF含量、及其受體的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)二者都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對照組相比，5%含藥血清對VEGF本身的轉(zhuǎn)錄有影響;而對VEGF及其受體的表達(dá)均無顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。

表1 破血化瘀湯對VEGF表達(dá)的影響

注：A-C依次為1.25%，2.5%，5%破血化瘀湯劑血清；D-F依次為1.25%，2.5%，5%空白血清

圖1 RT-PCR 檢測 VEGF mRNA 表達(dá)結(jié)果

4 破血化瘀湯劑對大鼠腦組織GAP-43蛋白表達(dá)的影響 高倍鏡下大鼠腦組織GAP-43陽性細(xì)胞，顏色呈淡黃色或棕黃色，主要表達(dá)于血腫區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中，膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量表達(dá)。造模后的第5天，各破血化瘀GAP-43均有表達(dá)，隨時(shí)間增加表達(dá)也隨之增加，在第10天后，開始有不同程度下降。與空白組相比，破血化瘀湯組第10天、15 天的GAP—43陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)比較

討 論

急性腦內(nèi)血腫是指由于外傷導(dǎo)致顱內(nèi)出血，隨著出血加重，血腫迅速形成，并在72 h內(nèi)造成顱內(nèi)壓升高或者腦疝形成[9-10]。腦內(nèi)血腫常發(fā)生的部位大致在硬膜外、硬膜下及腦內(nèi)三類，不同的損傷部位，患者的病情程度也不同。硬膜外血腫受損程度較輕，患者在昏迷之間伴隨清醒；硬膜下血腫相對之下，昏迷發(fā)生快、昏迷時(shí)間持續(xù)長、顱內(nèi)壓突發(fā)升高，不易控制；腦內(nèi)血腫患者的腦實(shí)質(zhì)受損較為嚴(yán)重，由輕度昏迷轉(zhuǎn)變深度昏迷，支配重要功能的部位易被血腫壓迫，預(yù)后較差[11-14]。若臨床恢復(fù)期除了采取一般的西醫(yī)治療以外，配合使用適宜的中藥湯劑，對癥治療，能夠盡快幫助患者預(yù)后恢復(fù)，早日返回日常生活當(dāng)中。

本實(shí)驗(yàn)中VEGF ELISA 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5%含藥血清與2.5%空白對照組相比能顯著提高血管內(nèi)皮生長因子VEGF的含量，說明該濃度的含藥血清能夠顯著促進(jìn)VEGF的分泌;而1.25%和5%的含藥血清對VEGF的作用不是十分顯著。而圖像分析結(jié)果顯示，與同血清含量的空白對照相比，2.5%含藥血清組細(xì)胞內(nèi)VEGF相對含量最高，能顯著促進(jìn)VEGF的合成，而另外兩種藥物濃度對VEGF的含量與合成均無顯著影響。RT-PCR的檢測結(jié)果顯示2.5%含藥血清與2.5%的空白對照組相比，血管內(nèi)皮生長因子VEGF含量、及其受體的轉(zhuǎn)錄水平都顯著提高;而較高濃度5%含藥血清與5%的空白對照組相比，5%含藥血清對VEGF本身的轉(zhuǎn)錄有影響，而對VEGF及其受體的表達(dá)均無顯著影響是較低濃度1.25%含藥血清。表明破血化瘀湯劑可以促進(jìn)腦內(nèi)血管內(nèi)皮的生長因子VEGF，不同藥物濃度對 VEGF的影響也不同，灌胃給藥10 d后的正常大鼠，血清中VEGF含量明顯升高，同時(shí)，僅2.5%濃度含藥血清能顯著促進(jìn)VEGF的合成。

正常生理狀態(tài)下，生長相關(guān)蛋白-43(Growth associated protein,GAP-43)處于低水平，而當(dāng)腦神經(jīng)損傷時(shí), GAP-43表達(dá)的增高是內(nèi)源性神經(jīng)再生的顯著特征[15]。因此, GAP-43可以用來標(biāo)記神經(jīng)元發(fā)育生長、神經(jīng)再生以及成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸重建。故GAP-43高表達(dá)是在腦組織因缺血、缺氧，激活神經(jīng)纖維發(fā)芽、突觸重建的神經(jīng)再生的過程[16]。實(shí)驗(yàn)中，GAP-43在腦血腫后第5天就開始表達(dá)，至第10天逐漸降低，表明破血化瘀湯劑可以有效提高腦血腫大鼠腦組織GAP-43陽性表達(dá)，并延緩其下降，從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)的再生，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)能力。

總之，破血化瘀湯劑有助于促進(jìn)急性腦內(nèi)血腫血管內(nèi)皮VEGF的生長以及利于大腦神經(jīng)元神經(jīng)GAP-43再生。