小鼠miR-487b-3p對C2C12增殖和分化調(diào)控作用的研究

凌笑笑，唐 朋,2，賈聰俊，梁春年，吳曉云，褚 敏，閻 萍*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點實驗室，蘭州 730050； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，蘭州 730050)

骨骼肌約占軀體重量的40%，具有維持機體能量需求、保持姿勢和保護軟組織等功能。骨骼肌正常發(fā)育是動物維持正常生命活動與代謝的先決條件，任何非正常發(fā)育都會導致疾病發(fā)生，如肌營養(yǎng)不良、肌萎縮、肌肉肥大等，極大地降低動物的生產(chǎn)性能。了解骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳因子以及相關(guān)信號通路，可為更好地預防、治療肌肉疾病和提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益奠定基礎(chǔ)。骨骼肌的生長發(fā)育是一個長期且復雜的生理過程，可將其大體分為4個階段，主要包括位于生皮肌節(jié)中的生肌前體細胞增殖，成肌細胞形成、增殖、分化和融合生成肌管，肌纖維和肌肉組織的形成[1]。骨骼肌的發(fā)育離不開眾多因子的精準調(diào)控，許多與細胞增殖、分化、再生、遷移和凋亡相關(guān)基因相互作用，形成一個復雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡來維持骨骼肌正常的形態(tài)以及收縮功能。以往研究表明，miRNAs作為重要的調(diào)控因子在骨骼肌發(fā)育、肌纖維形態(tài)和結(jié)構(gòu)的維持以及肌細胞生存等生物學過程中發(fā)揮重要作用[2]。

miRNAs是一類長度為18～22 nt的非編碼小RNA，其通過與靶mRNA 3′ UTR堿基互補配對調(diào)控靶基因的表達，進而發(fā)揮其功能[3-4]。目前，大量報道表明，miRNAs參與調(diào)控成肌細胞的增殖與分化。miR-98通過直接對E2F5(轉(zhuǎn)錄抑制因子)的調(diào)控參與到骨骼肌細胞的分化過程[5]。miR-374b 可以直接靶向MYF6，抑制C2C12細胞的分化。miR-140-3p通過抑制myomaker的表達，抑制成肌細胞融合與分化[6]。miR-151-3p通過抑制ATP2a2表達來調(diào)控慢肌基因的表達[7]。miR-30-5p可以靶向MBNL調(diào)控肌肉分化[8]。miR-128靶向MSTN(肌生成抑制素)，促進肌細胞增殖，抑制其分化[9]。越來越多的研究表明，miR-487b-3p參與多種生命活動的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p作為抑癌基因抑制多種腫瘤增殖、遷移和侵襲[10-11]。近年來也有研究表明，miR-487b-3p抑制C2C12成肌細胞的分化[12]。但miR-487b-3p影響骨骼肌發(fā)育的具體機制卻少有報道。因此，本試驗通過在小鼠C2C12成肌細胞中過表達和抑制miR-487b-3p，探究miR-487b-3p對細胞增殖與分化的調(diào)控作用。

Wnt信號通路是參與肌肉發(fā)育的一個重要通路，PITX2作為Wnt信號通路上的一個轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與生物體的早期發(fā)育進程[13-14]。有研究表明，PITX2是眼外肌生成的激活劑，參與調(diào)控眼肌發(fā)育[15-16]。Kumar和Moses[17]研究發(fā)現(xiàn)，PITX2參與細胞定型與特化過程，對生物體的遺傳發(fā)育具有重要作用，還有大量研究表明，PITX2在多種組織器官的形成中發(fā)揮重要作用[18-20]，推測其可能參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控。Lozano-Velasco等[14]研究表明，PITX2可通過下調(diào)miR-15b、miR-23b、miR-106b、miR-503促進成肌細胞增殖，PITX2-微小RNA(miRNA)途徑還可以促進早期活化的衛(wèi)星細胞增殖，增強MYF5基因的表達，促進衛(wèi)星細胞定向分化為生肌細胞。MYOD基因是控制骨骼肌發(fā)生的核心調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的一部分，并且是肌細胞命運的基本決定因素，PITX2通過與MYOD核心增強子的直接結(jié)合激活肢體肌肉前體細胞中的MYOD基因[21]。綜上推測PITX2參與肌肉發(fā)育的調(diào)控。

本研究利用生物信息學軟件預測miR-487b-3p與PITX2的靶標關(guān)系，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)來驗證這種關(guān)系。探究miR-487b-3p在小鼠C2C12成肌細胞增殖和分化中的作用及可能的分子機制，為后期家畜肌肉發(fā)育機理研究和產(chǎn)肉性能的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

C2C12成肌細胞系購自中國科學院上海細胞庫；Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit雙熒光素酶檢測試劑盒購自Biovision公司(美國)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、青/鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司；miRNA mimics、inhibitor、negative control、inhibitor negative control均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；miRNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa大連寶生物公司；CCK-8、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗PCNA、一抗MYOD、一抗MYOG、一抗MYHC、一抗β-actin和二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 小鼠miR-487b-3p靶基因預測

利用miRNA靶基因預測軟件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRDB(http://www.mirdb.org/)對miR-487b-3p的靶基因進行預測，查閱大量相關(guān)文獻后，篩選出與肌肉發(fā)育相關(guān)的靶基因PITX2。

1.3 構(gòu)建小鼠miR-487b-3p靶基因的突變型與野生型載體

本研究選擇pmirGLO Vector(Promega)作為載體骨架，其載體結(jié)構(gòu)見圖1。構(gòu)建重組載體時，首先得到靶基因PITX2與miR-487b-3p的結(jié)合位點，并獲取包括結(jié)合位點在內(nèi)的70 bp的PITX2 3′ UTR，此序列為野生型序列，而突變序列是把預測可能結(jié)合的位點突變成它的反向互補序列，具體信息見圖2。堿基合成后直接將其連入載體質(zhì)粒中，通過測序以驗證序列的準確性。

圖1 pmirGLO載體圖
Fig.1 Map of pmirGLO vector

1.4 小鼠C2C12細胞培養(yǎng)

將小鼠C2C12細胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴中使其快速融化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。

斜體部分為小鼠PITX2 3′ UTR突變型與野生型載體的差異堿基序列
Italic parts represent the different sequences between wild-type(WT) and mutant-type(MT) vectors of mouse PITX2 3′ UTR(mut)
圖2 PITX2 3′ UTR野生型與突變型載體序列信息
Fig.2 The sequence information of wild-type and mutant-type vectors of PITX2 3′ UTR

用完全培養(yǎng)基(10% FBS和90% DMEM)重懸細胞懸液至適當接種濃度，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36和48 h觀察細胞生長狀態(tài)并拍照，同時提取各時間點細胞總RNA。

當C2C12細胞生長至90%以上匯合度時，采用血清撤離方法誘導C2C12細胞成肌分化。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1次，加入分化培養(yǎng)基(2%馬血清和98% DMEM)，記為D0天，每天更換1次培養(yǎng)基，在分化培養(yǎng)的D0、D1、D3、D5、D7分別收取細胞，用于熒光定量PCR檢測不同分化階段miR-487b-3p及相關(guān)基因的表達趨勢。

1.5 小鼠C2C12細胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性分析

1.5.1 miR-487b-3p mimics(inhibitor)單轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d取生長旺盛的C2C12細胞，經(jīng)清洗、胰酶消化和離心后，顯微鏡下細胞計數(shù)，傳代于6孔板(5× 104)或96孔板(2×103)中，輕輕晃動板子，使細胞均勻分布。待細胞長至70%左右密度時，將培養(yǎng)基更換為OPTI-DMEM(無血清培養(yǎng)基)，饑餓細胞4 h，然后將miR-487b-3p mimics(M)、miR-487b-3p inhibitor(I)、Mimics Negative Control(MNC)、Inhibitor Negative Control(INC)與OPTI-DMEM混合，lip 3000與OPTI-DMEM混合，靜置5 min，將兩者輕輕混勻后室溫靜置20 min，逐滴加入培養(yǎng)基使mimics或MNC(inhibitor或INC)轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol·L-1(100 nmol·L-1)。

1.5.2 載體pmir-PITX2與miR-487b-3p mimics共轉(zhuǎn)染 將C2C12細胞接種至24孔板，待細胞密度達70%左右。利用lip 3000將miR-487b-3p mimics和雙熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換為完全培養(yǎng)基(10% FBS+90% DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收細胞。將轉(zhuǎn)染試驗分為4個組：miR-487b-3p mimics+pmir-PITX2-3′ UTR -WT；MNC+pmir-PITX2-3′ UTR-WT；miR-487b-3p mimics+pmir-PITX2-3′ UTR-MT；MNC+pmir-PITX2-3′ UTR-MT。

1.5.3 雙熒光素酶活性檢測 按照Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit(Biovision)說明書向每孔中加入適量細胞裂解液，室溫孵育10 min；10 000 g離心5 min，取上清作為待測液；取100 μL待測液加入96孔發(fā)光板中，加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測工作液，吹吸混勻；放入化學發(fā)光儀(中生北控BK-L96C)測定發(fā)光值，積分時間5 s，得到螢火蟲熒光素酶活性值；加入海腎熒光素酶檢測工作液100 μL，吹打混勻，上機測定發(fā)光值，積分時間5 s，得到海腎熒光素酶活性值。

1.6 CCK-8法檢測小鼠C2C12細胞增殖情況

將處于對數(shù)生長期的C2C12成肌細胞均勻接種到96孔板中，每個處理6個重復，并在4個空孔中加入等量培養(yǎng)基作為空白對照。在轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72 h分別從培養(yǎng)箱中取出一個96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液(盡量不要產(chǎn)生氣泡，否則影響OD值讀數(shù))，孵育1～2 h后用酶標儀檢測450 nm處的OD值，并繪制細胞生長曲線。

1.7 qRT-PCR檢測小鼠miR-487b-3p和相關(guān)目的基因的表達

1.7.1 小鼠miR-487b-3p和相關(guān)目的基因擴增引物的設(shè)計 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫獲得小鼠miR-487b-3p成熟序列，設(shè)計miR-487b-3p特異性熒光定量引物；登錄NCBI數(shù)據(jù)庫獲得目的基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計跨內(nèi)含子的特異性熒光定量引物。引物序列見表1，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

1.7.2 小鼠miR-487b-3p和目的基因的qRT-PCR分析 根據(jù)miRNeasy Mini Kit(Qiagen)說明書提取細胞總RNA。NanoDrop 2000微量分光光度計檢測總RNA的完整性和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行miRNA和mRNA反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA產(chǎn)物作為qRT-PCR的模板，檢測miR-487b-3p和目的基因的表達情況。

表1qRT-PCR引物序列

Table1ThesequencesofqRT-PCRprimers

基因Gene引物序列(5′→3′)Sequence退火溫度/℃TmmiR-487b-3pF:AATCGTACAGGGTCATCCACTTR:TGCAGGTCAACTGGTGTCGT60U6F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAATR: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT60PCNAF:TATGCCGAGACCTTAGCCAR:CGCCTCCTCTTCTTTATCCA60MYODF:CGCAACGCCATCCGCTACATR:GGTGTCGTAGCCATTCTGCCG60MYOGF:AGCGGCTGCCTAAAGTGGAGAR:TTGTGGGCGTCTGTAGGGTCA60MYHCF:GGAAGTATGAGCGGCGTGTTAR:GGGCTTTCCTGAACTTGGTG60GAPDHF:GCTGCCCAGAACATCATCCCTR:CCTCAGATGCCTGCTTCACCA60PITX2F: CAACCTTACGGAAGCCCGAGTCR: TGGTGGACAGAGACGCTGACG60

1.8 蛋白免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的表達

將C2C12細胞培養(yǎng)板(6孔板)從培養(yǎng)箱中取出，PBS清洗2次，加入適量含1% PMSF的RIPA裂解液(碧云天)，冰上放置30 min，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，12 000 g，4 ℃離心15 min，小心吸取上清，分裝后-80 ℃保存。根據(jù)目的蛋白的大小配制相應濃度分離膠，濃縮膠濃度一般為5%。取出蛋白溶液置于冰上解凍，采用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測定蛋白濃度，隨后調(diào)整至同一濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，封口膜封好后100 ℃煮沸10 min，冷卻后加入到膠孔中，在80 V恒壓下緩慢電泳至濃縮膠與分離膠界面，然后120 V恒壓電泳至溴酚藍跑至膠底部，開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜前PVDF膜置于甲醇中浸泡活化2 min，海綿和濾紙置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中備用。根據(jù)目的蛋白大小進行切膠，并按照海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙和海綿的三明治緊密排列順序恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，并將其放入5% BSA中，室溫封閉1～2 h(根據(jù)抗體而定)。隨后將PVDF膜放入一定配比的一抗孵育液中，4 ℃過夜。TBST搖動洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記二抗孵育液，室溫放置60 min。倒掉二抗，TBST搖動洗膜3次，每次10 min。膜上滴加ECL顯影液，待膜表面全部被顯影液覆蓋，置于FluorChem R多功能成像分析系統(tǒng)中曝光并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用相對定量的方法，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算miR-487b-3p和相關(guān)基因mRNA的相對表達量。雙熒光素酶活性采用螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值計算。所有數(shù)據(jù)至少重復3次，以SPSS 21.0軟件中雙尾t檢驗進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。P<0.05為顯著水平。采用數(shù)據(jù)分析軟件GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結(jié) 果

2.1 miR-487b-3p小鼠組織表達譜檢測

qRT-PCR檢測miR-487b-3p在小鼠各組織中的表達情況，如圖3所示，miR-487b-3p在小鼠各個組織中廣泛表達，骨骼肌中相對表達最高，其次是脂肪。推測miR-487b-3p在小鼠骨骼肌中發(fā)揮重要作用。

H. 心；L1. 肝；S. 脾；L2. 肺；K. 腎；M. 骨骼??；F. 脂肪
H. Heart；L1. Liver；S. Spleen；L2. Lung；K. Kidney；M. Skeletal muscle；F. Fat
圖3 miR-487b-3p在小鼠不同組織中的表達
Fig.3 Expression of miR-487b-3p in mouse different tissues

2.2 小鼠miR-487b-3p在C2C12細胞增殖過程中的表達

顯微鏡下觀察同一區(qū)域C2C12細胞在增殖不同時間點的形態(tài)學變化。如圖4所示，在C2C12細胞增殖過程中，細胞數(shù)量明顯增加，增殖48 h后，細胞出現(xiàn)融合趨勢。qRT-PCR檢測分析后發(fā)現(xiàn)(圖5)，隨著C2C12細胞生長時間增加，miR-487b-3p表達量均逐漸升高。與12 h相比，miR-487b-3p在48 h 表達量極顯著上升(P<0.01)。

2.3 小鼠miR-487b-3p在C2C12細胞分化過程中的表達

C2C12細胞在分化不同時間點的細胞形態(tài)學變化如圖6所示。隨著誘導天數(shù)的不斷增加，肌管形成越來越明顯。誘導分化1 d后，細胞開始縱向分布，有少數(shù)細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象；3 d后出現(xiàn)較多的多核肌管，單核細胞變少；5 d后肌管變粗變長，分化明顯。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖7)，隨著誘導時間延長，MYHC表達量呈上升趨勢。

圖4 C2C12成肌細胞在增殖過程中的形態(tài)變化(100×)
Fig.4 Morphological changes of C2C12 myoblasts during proliferation(100×)

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下同
* indicate significant difference(P<0.05)，** indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as follows
圖5 miR-487b-3p在C2C12成肌細胞增殖過程中的時序表達
Fig.5 Expression of miR-487b-3p during C2C12 myoblasts
proliferation

與D0相比，MYHCmRNA表達量在D3、D5和D7均極顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果顯示，體外成功誘導小鼠C2C12成肌細胞分化。

利用qRT-PCR檢測miR-487b-3p在分化D0、D1、D3、D5和D7的表達模式。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8)，隨著分化的進程，miR-487b-3p在C2C12細胞中的表達呈現(xiàn)上升趨勢。與D0相比，C2C12細胞在D7中miR-487b-3p的表達量極顯著上升(P<0.01)，推測miR-487b-3p對C2C12成肌細胞的分化可能具有重要調(diào)控作用。

2.4 小鼠C2C12細胞轉(zhuǎn)染效率檢測

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為10% FBS的完全培養(yǎng)基，24 h后收集細胞提取總RNA，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，如圖9所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染mimics組miR-487b-3p的表達量極顯著上升(P<0.01)，而inhibitor組miR-487b-3p的表達量極顯著降低(P<0.01)，表明細胞轉(zhuǎn)染成功。

圖6 C2C12成肌細胞在分化過程中的形態(tài)變化(400×)
Fig.6 Morphological changes of C2C12 myoblasts during differentiation(400×)

圖7 C2C12細胞分化狀態(tài)下MYHC的表達趨勢
Fig.7 Expression of MYHC during C2C12 myoblasts differentiation

圖8 miR-487b-3p在C2C12細胞分化過程中的表達
Fig.8 Expression of miR-487b-3p during C2C12 myoblasts differentiation

圖9 轉(zhuǎn)染效率的檢測
Fig.9 The detection of transfection efficiency

2.5 小鼠miR-487b-3p促進C2C12成肌細胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為10% FBS的完全培養(yǎng)基，此時記為0 h，36 h后收集細胞提取總RNA和總蛋白，檢測增殖標志基因PCNA的表達變化。如圖10～12所示，與對照組相比，過表達miR-487b-3p組細胞PCNA在mRNA和蛋白水平均極顯著上升(P<0.01)；而抑制miR-487b-3p使PCNA在mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)水平顯著降低。CCK-8結(jié)果顯示(圖13)，與對照相比，miR-487b-3p mimics處理48 h 后顯著促進細胞生長，miR-487b-3p mimics組細胞在450 nm處的OD值極顯著增加(P<0.01)；與對照相比，轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor組細胞在培養(yǎng)36 h后生長受到抑制，且隨著時間延長，抑制作用顯著(P<0.05)。綜上可知，過表達miR-487b-3p促進C2C12細胞增殖。

2.6 小鼠miR-487b-3p抑制C2C12細胞分化

轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics(inhibitor)12 h后，更換為生長培養(yǎng)基(10% FBS，90% DMEM)培養(yǎng)24 h，細胞密度達到90%左右時，更換分化培養(yǎng)基(2%馬血清，98% DMEM)，此時記為0 h，96 h后收集細胞提取總RNA和總蛋白，檢測分化標志基因MYHC、MYOD和MYOG的表達變化。qRT-PCR檢測結(jié)果如圖14所示，過表達miR-487b-3p后，MYOD、MYHC和MYOG在轉(zhuǎn)錄水平的表達量均顯著下降(P<0.05)；抑制miR-487b-3p后，MYOD、MYHC和MYOGmRNA的表達量增加，但未達到顯著水平(P>0.05)。Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖15～16)，過表達miR-487b-3p組顯著抑制MYHC(P<0.05)、MYOD(P<0.01)、MYOG(P<0.05)蛋白表達；而抑制miR-487b-3p組顯著增加MYOD、MYHC和MYOG蛋白表達量(P<0.05)。

圖10 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后C2C12細胞中PCNA的表達情況
Fig.10 Expression of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics, inhibitor

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細胞中PCNA蛋白Western blotting檢測；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細胞中PCNA蛋白相對表達量檢測
A shows the Western blotting analysis of PCNA protein in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics; B shows the expression level of PCNA protein detected by Western blotting after miR-487b-3p mimics transfecting into C2C12 cells
圖11 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后C2C12細胞中PCNA蛋白表達檢測
Fig.11 Western blotting analysis of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細胞中PCNA蛋白Western blotting檢測；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細胞中PCNA蛋白相對表達量檢測
A shows the Western blotting analysis of PCNA protein in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor; B shows the expression level of PCNA protein detected by Western blotting after miR-487b-3p inhibitor transfecting into C2C12 cells
圖12 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后C2C12細胞中PCNA蛋白表達檢測
Fig.12 Western blotting analysis of PCNA in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor

圖13 CCK-8檢測miR-487b-3p mimics、inhibitor對C2C12細胞增殖的影響
Fig.13 Effect of miR-487b-3p mimics, inhibitor on C2C12 cells proliferation by CCK-8 test

圖14 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后C2C12細胞中分化標記基因的表達情況
Fig.14 Expression of differentiation marker genes in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics, inhibitor

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白Western blotting檢測；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后，C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白相對表達量檢測
A shows the Western blotting analysis of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics; B shows the expression levels of differentiation-related proteins detected by Western blotting after miR-487b-3p mimics transfecting into C2C12 cells
圖15 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics后C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白的表達情況
Fig.15 Expression of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p mimics

2.7 小鼠miR-487b-3p的靶基因預測

運用生物信息學軟件預測小鼠miR-487b-3p的靶基因，結(jié)果顯示，配對樣同源域轉(zhuǎn)錄因子2(paired-like homeodomain transcription factor 2，PITX2)基因的3′ UTR有miR-487b-3p的結(jié)合位點(圖17)。前期研究表明，PITX2作為Wnt信號通路中的調(diào)控因子，在多種組織器官的形成中發(fā)揮重要作用[18-20]，因此推測，PITX2有可能參與肌肉發(fā)育的調(diào)控。

2.8 小鼠miR-487b-3p的表達水平與靶基因PITX2的關(guān)系

為了確定miR-487b-3p與PITX2之間的關(guān)系，利用qRT-PCR初步驗證miRNAs與預測的靶基因的表達量是否存在負相關(guān)。如圖18所示，在C2C12細胞增殖階段，PITX2的表達量處于一個較穩(wěn)定的水平，而在分化階段，PITX2表達量起伏較明顯，整體呈現(xiàn)下降趨勢。

如圖19所示，與MNC相比，過表達miR-487b-3p后PITX2 mRNA表達量極顯著降低(P<0.01)；將miR-487b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染C2C12細胞后，PITX2 mRNA表達量極顯著上升(P<0.01)。

A.轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白Western blotting檢測；B. 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后，C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白相對表達量檢測
A shows the Western blotting analysis of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor; B shows the expression levels of differentiation-related proteins detected by Western blotting after miR-487b-3p inhibitor transfecting into C2C12 cells
圖16 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p inhibitor后C2C12細胞中分化相關(guān)蛋白的表達情況
Fig.16 Expression of differentiation-related proteins in C2C12 cells transfected with miR-487b-3p inhibitor

圖17 miR-487b-3p與PITX2 3′ UTR的結(jié)合位點
Fig.17 The binding site of miR-487b-3p to PITX2 3′ UTR

A.PITX2在C2C12細胞增殖階段的表達；B. PITX2在C2C12細胞分化階段的表達
A. Expression of PITX2 during C2C12 cells proliferation; B. Expression of PITX2 during C2C12 cells differentiation
圖18 PITX2在C2C12成肌細胞增殖及分化過程中的表達模式
Fig.18 Expression patterns of PITX2 during the proliferation and differentiation of C2C12 myoblasts

2.9 C2C12細胞中驗證miR-487b-3p的直接靶基因PITX2

如圖20所示，miR-487b-3p與野生型載體共轉(zhuǎn)染后檢測到熒光素酶活性(螢火蟲熒光活性/海腎熒光活性比值)顯著降低(P<0.01)，而與突變型載體共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性與對照相比無顯著變化(P>0.05)， 綜上可知，miR-487b-3p靶向PITX2發(fā)揮其功能。

圖19 轉(zhuǎn)染miR-487b-3p mimics、inhibitor后PITX2 mRNA相對表達量
Fig.19 The relative expression of PITX2 mRNA after transfection of miR-487b-3p mimics, inhibitor

WT.野生型；MT.突變型
WT. Wild type; MT. Mutant type
圖20 miR-487b-3p與PITX2作用關(guān)系分析
Fig.20 The relationship analysis between miR-487b-3p and PITX2

3 討 論

骨骼肌發(fā)育離不開成肌細胞的增殖和分化這兩個重要的生物學過程，探討miRNAs對骨骼肌細胞增殖與分化的調(diào)控是研究骨骼肌發(fā)育的核心內(nèi)容。其中MYOD調(diào)控骨骼肌干細胞定向分化為成肌細胞，參與成肌分化的初始階段，MYOG和MYHC主要調(diào)控成肌細胞分化為肌纖維和肌肉組織，參與成肌分化的終末階段[22]。目前，關(guān)于miRNAs對成肌細胞分化的調(diào)控研究中，均采用MYOD、MYOG和MYHC基因的表達量來反映成肌細胞分化程度，進而確定miRNAs對成肌細胞分化的具體作用機制[23-25]。增殖細胞核抗原(PCNA)是一個同源三聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與許多分子互作共同參與DNA代謝各個方面的調(diào)控，包括DNA復制、DNA修復、細胞周期調(diào)節(jié)和染色質(zhì)重塑，其表達量直接反映細胞增殖情況[26]。因此，本試驗通過獲得性和缺失性研究將外源miR-487b-3p mimics和inhibitor分別導入小鼠C2C12細胞，通過比較MYOD、MYOG和MYHC基因表達量分析不同處理組C2C12成肌細胞的分化程度，比較PCNA基因的表達量來分析C2C12細胞增殖情況進而確定miR-487b-3p在骨骼肌發(fā)育過程中的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-487b-3p顯著提高增殖標記基因PCNA的表達量，降低分化標記基因MYOD、MYOG和MYHC的表達水平；而抑制miR-487b-3p則降低PCNA的表達，促進MYOD、MYOG和MYHC的表達?？梢?，miR-487b-3p促進C2C12細胞增殖但抑制其分化。這與Katase等[12]的研究結(jié)果相一致。對癌癥的研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p可抑制多種類型癌細胞增殖[10-11]。推測miR-487b-3p在不同生理過程中發(fā)揮不同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p在小鼠體內(nèi)各個組織均有表達，說明miR-487b-3p廣泛參與到小鼠的各項生命活動，且在小鼠C2C12成肌細胞增殖與分化過程中存在差異表達。由此，筆者推測miR-487b-3p可能參與骨骼肌細胞的發(fā)育。在C2C12細胞分化過程中，隨著分化的進程，miR-487b-3p的表達呈現(xiàn)上升趨勢。在分化第1天表達量降低可能是由于細胞間接觸，增殖受到抑制，分化第5天miR-487b-3p表達量低于第3天可能是由于分化較明顯的狀態(tài)導致其他信號通路激活，影響其表達，具體原因有待進一步研究。

miRNAs主要通過與靶基因3′ UTR區(qū)域互補配對來降解靶基因或抑制其翻譯，完成對靶基因的調(diào)控，來影響靶基因所在的相關(guān)通路，進而參與調(diào)控動物體生長發(fā)育、代謝及癌癥發(fā)生，因此準確篩選miRNAs作用的靶基因?qū)τ诔浞至私鈓iRNAs的功能具有十分重要的意義。本研究預測與肌肉發(fā)育相關(guān)信號通路上的PITX2為miR-487b-3p的靶基因，推測其可能參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控。本研究利用qRT-PCR檢測小鼠C2C12細胞增殖與分化中和過表達(抑制)miR-487b-3p后PITX2基因表達量，發(fā)現(xiàn)PITX2與miR-487b-3p表達趨勢相反，進一步采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-487b-3p和PITX2的靶向關(guān)系?？梢?，miR-487b-3p通過靶向PITX2參與調(diào)控C2C12細胞增殖與分化。Katase等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p通過靶向Wnt3a和Wnt5a參與調(diào)控C2C12細胞成肌分化，與本研究結(jié)果不同，可能是由于一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因共同完成對骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，miR-487b-3p在小鼠各組織均有表達，其在骨骼肌中相對表達最高。miR-487b-3p過表達和抑制表達試驗發(fā)現(xiàn)，miR-487b-3p促進小鼠C2C12細胞增殖但抑制其分化。雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-487b-3p通過靶向PITX2參與骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。