TRPV6基因沉默對(duì)蛋雞十二指腸和空腸鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

孟范勇，鄧益鋒，楊俊花，崔 軍，周振雷，侯加法*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403)

蛋雞在產(chǎn)蛋高峰每天需補(bǔ)充大量的鈣質(zhì)以滿足蛋殼鈣化的需要，每個(gè)雞蛋含鈣2～3 g，年產(chǎn)300枚以上的現(xiàn)代商品蛋雞，鈣的消耗是其體內(nèi)鈣總量的30倍[1-2]。腸道作為蛋殼鈣源的主要來(lái)源必須保持高效的運(yùn)轉(zhuǎn)以滿足這種連續(xù)高產(chǎn)的要求，一旦發(fā)生腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，極易引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降，誘發(fā)骨質(zhì)疏松等疾病。多年來(lái)，科研人員一直致力于蛋雞腸道內(nèi)鈣離子高效轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制探索。研究發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)包括兩種有效途徑：不飽和旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和飽和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，其中以瞬時(shí)性受體電位通道香草酸受體6(transient receptor potential vanilloid receptor 6, TRPV6)為限速步驟的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在動(dòng)物腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起重要作用。主要包括以下三個(gè)步驟：首先通過(guò)TRPV6跨膜通道把鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)；然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子與calbindin-D28K(CaBP-D28K為禽類主要形式)和(或)calbindin-D9K(CaBP-D9K)結(jié)合并擴(kuò)散至基底膜；最后，通過(guò)膜上的鈉-鈣交換蛋白1(NCX1)、ATP依賴的細(xì)胞膜鈣離子ATP泵(PMCA 1b)把鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外[3]。研究表明，這些蛋白主要承擔(dān)維持機(jī)體鈣離子平衡，保障鈣離子參與的生理活動(dòng)：骨形成、肌肉收縮、程序化細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖過(guò)程、離子代謝、凝血等[4]。TRPV6是瞬時(shí)性受體電位通道(transient receptor potential，TRP)超家族中的成員，是專門的上皮樣鈣離子“門控”通道，在兔、鼠和人的胰腺、十二指腸、空腸、結(jié)腸、骨組織等與鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)的器官都有表達(dá)[5-8]。在敲除小鼠的TRPV6基因后，腸道呈現(xiàn)嚴(yán)重的鈣離子吸收異常，以及腎重吸收障礙[6]，表明TRPV6在調(diào)控腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要意義。實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，TRPV6在蛋雞腸道上皮細(xì)胞也存在高表達(dá)，并且十二指腸表達(dá)量顯著高于其他腸段[9]。其他研究顯示，在禽類組織，鈣的吸收幾乎局限在十二指腸和空腸，回腸和結(jié)腸幾乎沒(méi)有吸收[10]，故推測(cè)TRPV6在蛋雞腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于產(chǎn)蛋高峰期TRPV6在腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用還未曾報(bào)道。因此，本項(xiàng)目擬采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，體外構(gòu)建TRPV6的RNAi干擾質(zhì)粒，注入產(chǎn)蛋雞體內(nèi)，采用基因沉默手段研究TRPV6對(duì)小腸內(nèi)鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)作用，旨在闡明TRPV6在蛋雞腸道內(nèi)調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制，為蛋雞腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙及骨代謝異常致病機(jī)制及防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組pSIREN-TRPV6-3質(zhì)粒(由本實(shí)驗(yàn)室保存)。E.coliCompetent Cells DH5α、限制性內(nèi)切酶MluⅠ、Trans 2KTMPlusⅡDNA Marker、Mini BEST Plasmid Purification Kit質(zhì)粒小提試劑盒、SYBR Prime Script PR-PCR Kit、SYBR Premix ExTaqKit均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa，日本)。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA。TRPV6兔抗人多克隆抗體購(gòu)自以色列Alamone Labs(ACC-036)，CaBP-D28K鼠單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，GAPDH鼠克隆抗體購(gòu)自上海康城生物技術(shù)有限公司(KC-5G4)。雞源甲狀旁腺素(PTH)ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，-80 ℃超低溫冰箱，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司，中國(guó))，核酸蛋白檢測(cè)儀(Eppendorf，德國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(TanonGIS-2500，上海)，DNA電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7300(ABI，美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取、酶切鑒定與測(cè)序 攜帶質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3的大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。選取陽(yáng)性克隆菌，在含有氨芐青霉素(AMP)100 μg·mL-1的LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)18 h。使用TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification Kit(按照說(shuō)明書操作)提取質(zhì)粒DNA，然后用MluⅠ酶切。將酶切產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。提取到的重組質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen-TRPV6-siRNA寄往上海英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定以鑒定TRPV6-shRNA是否插入正確，pSIREN序列引物為5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′。

1.2.2 重組質(zhì)粒注射液準(zhǔn)備 根據(jù)N/P比值計(jì)算公式[11]：N/P=PEI (μg)/DNA(μg)×7.75進(jìn)行計(jì)算。按照N/P比值為10，將重組質(zhì)粒與聚乙烯亞胺(PEI)混合，溶于生理鹽水，振蕩混勻，靜置15 min， 在30 min內(nèi)注射入蛋雞左側(cè)大腿肌肉，每只蛋雞注射相應(yīng)質(zhì)粒200 μg(0.5 mL)。

1.2.3 動(dòng)物飼料管理及樣品采集 64羽220日齡精神狀況良好、體重一致的伊莎高產(chǎn)蛋雞，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組32只。試驗(yàn)組一次性肌內(nèi)注射0.5 mL質(zhì)粒注射液(生理鹽水稀釋)，對(duì)照組注射生理鹽水做空白對(duì)照，預(yù)試期1周，連續(xù)觀察28 d。

同舍飼養(yǎng)于階梯式蛋雞籠，依籠編號(hào)，按照集約化蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)方法飼養(yǎng)管理，雞舍采用自然光與人工補(bǔ)充光照16∶8(L/D)。試驗(yàn)雞自由飲水，按照標(biāo)準(zhǔn)日糧飼喂。分別于注射后第7、14、21及28天翅靜脈采血5 mL，1%肝素抗凝，離心，血漿保存于EP管中，-20 ℃保存。然后每組選擇8只雞斷頭處死，采集十二指腸、空腸、股骨及脛骨。去除腸系膜及脂肪組織?？v向?qū)⒛c管剖開(kāi)，4 ℃預(yù)冷DEPC(焦磷酸二乙酯)配制PBS(pH7.4)緩沖液沖洗腸內(nèi)容物，吸水紙吸干水分。將樣品迅速裝入凍存管，液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 十二指腸和空腸中TRPV6轉(zhuǎn)染質(zhì)量鑒定 使用DNA提取試劑盒提取十二指腸和空腸中總DNA。PCR步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行， PCR產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物長(zhǎng)度為700 bp。設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒綠色熒光蛋白ZsGreen引物，F(xiàn): 5′-AAGGAGATGACCATGAAGTACCG-3′，R: 5′-AAACT-AGAGCCTGGACCACTGA-3′，由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明提取組織中總RNA，RNA濃度用nanodrop微量分光度計(jì)測(cè)定。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說(shuō)明配制20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，37 ℃反應(yīng)15 min， 85 ℃滅活5 s，cDNA樣品置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒，按說(shuō)明書冰上配制20 μL擴(kuò)增體系。目的基因擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。熔解曲線條件：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次，設(shè)空白作為對(duì)照。通過(guò)TRPV6、CaBP-D28K、NCX1、PMCA1b和β-actin基因在熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷循環(huán)數(shù)Ct值。用2-△△ Ct法以雞β-actin為內(nèi)參基因?qū)τ行У臄?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，算出TRPV6、CaBP-D28K、NCX1和PMCA1b基因在十二指腸與空腸的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已設(shè)計(jì)的雞TRPV6、CaBP-D28K、NCX1、PMCA1b引物序列及文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)參基因β-actin引物序列見(jiàn)表1，由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成引物。

1.2.7 Western blot分析 取組織100 mg于1 mL 裂解液中冰上勻漿，靜置30 min，待裂解完全，離心30 min (4 ℃，25 000 g)。取上清BCA法測(cè)定蛋白含量，按上樣緩沖液、樣品體積比1∶4混合，沸水加熱5 min，12 000 g離心5 min，取上清。每個(gè)樣品的上樣量為40～80 μg，在100 V、25～50 mA條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳。對(duì)照蛋白Marker，將膠條、硝酸纖維素膜切割至合適大小做好的“三明治”夾子放入轉(zhuǎn)印槽中，4 ℃、100 V條件下轉(zhuǎn)印80 min。 后將NC膜置5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。 棄封閉液，TBST洗膜。一抗孵育：加入按比例稀釋的抗體(用5%脫脂奶粉分別將TRPV6、CaBP-D28K、β-actin抗體以1∶200、1∶200、1∶10 000 比例稀釋)，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜，重復(fù)5次。二抗孵育：加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(TRPV6二抗為羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋；CaBP-D28K和β-actin 二抗為羊抗鼠IgG，1∶10 000稀釋)，室溫孵育2 h。TBST洗膜，將ECL試劑盒內(nèi)的試劑A與試劑B等體積混合后，均勻滴在硝酸纖維素膜上，5 min 后將硝酸纖維素膜和X線片同時(shí)置于暗盒中，壓片，根據(jù)熒光強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，顯影、定影。掃描儀拍照Western blot結(jié)果，用軟件檢測(cè)分析灰度值，并計(jì)算樣品中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1Real-timePCR目的基因引物序列

Table1PrimersequencesofReal-timePCRtargetgenes

目的基因Target genesPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLength of PCR productsGenBank登錄號(hào)GenBank accession No.引物序列(5′→3′)Primer sequences退火溫度和時(shí)間Annealing temperature and timeβ-actin300NM205518F:TGCGTGACATCAAGGAGAAGR:TGCCAGGGTACATTGTGGTATRPV6141XM416530F:TGGAACGGACTAAGTCAGAAGTTGR:CGTTATGGCTGGGATGTTGTTCaBP-D28K297EU404189F:TTAAATCTGCGTTGCTTCCATACAR:GGCCCATCCTGCACTCCATAACNCX1178DQ987923F:TCACCTTCTTCTTCTTCCCAATCTR:GCAACCTTTCCGTCCATCTCPMCA1b98XM416133F:TTCAGGTACTCATGTGATGGAAGGR:CAGCCCCAAGCAAGGTAAAG94 ℃, 15 s, 60～64 ℃, 10 s (40個(gè)循環(huán))

1.2.8 血鈣、血磷濃度及PTH水平測(cè)定 血液自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血鈣、血磷濃度，ELISA試劑盒測(cè)定血漿PTH濃度。

1.2.9 骨密度測(cè)定 剔凈附著在股骨和脛骨上的軟組織，與16級(jí)鋁階一同置于暗盒上拍片。脛骨和股骨采用前后位放置。拍攝條件：焦點(diǎn)焦片距(FFD)80 cm，球管電壓45 kV，2.5 mAs。在測(cè)定前，根據(jù)圖像情況進(jìn)行預(yù)處理，用NIH Image J圖像軟件處理，建立鋁階的厚度和灰度曲線，根據(jù)曲線，將測(cè)得的灰度信息轉(zhuǎn)化成鋁階厚度。骨密度以毫米鋁階厚度(mmAl)表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性檢驗(yàn)采用單因子方差分析(one-way ANOVA)，LSD進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 pSIREN-TRPV6-3質(zhì)粒酶切鑒定與測(cè)序

小量提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，用MluⅠ酶切消化，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)酶切后的質(zhì)粒只存在單一條帶，與未酶切質(zhì)粒存在差異，說(shuō)明shRNA片段連接在載體(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3中目的片段序列與設(shè)計(jì)的shRNA序列一致(圖2)。

1. 酶切的pSIREN-TRPV6-3質(zhì)粒；2. 未酶切的pSIREN-TRPV6-3質(zhì)粒；M. Trans2KTM PlusⅡDNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. Digested pSIREN-TRPV6-3 plasmid；2. Undigested pSIREN-TRPV6-3 plasmid；M. Trans2KTM PlusⅡ DNA marker
圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定
Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid

2.2 十二指腸與空腸內(nèi)重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3表達(dá)

圖3結(jié)果顯示，在第7、14及21天的十二指腸和空腸中均擴(kuò)增到重組質(zhì)粒中綠色熒光蛋白ZsGreen的表達(dá)，表明肌內(nèi)注射質(zhì)粒在十二指腸與空腸中均成功轉(zhuǎn)染。

2.3 TRPV6基因沉默對(duì)十二指腸和空腸鈣離子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

圖4和圖5結(jié)果顯示，在注射重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3后，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)第7、14及21天十二指腸、空腸中TRPV6和CaBP-D28K mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，其中第14天差異極顯著(P<0.01)，第28天 TRPV6表達(dá)有降低趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。但是，PMCA1b和NCX1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，結(jié)果表明TRPV6基因沉默嚴(yán)重干擾了腸道中TRPV6和CaBP-D28K的表達(dá)。

圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
Fig.2 Sequencing results of recombinant plasmid

1～5. 空白對(duì)照、第7、14、21、28天；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1-5. The control, the 7th, 14th, 21st and 28th day, respectively; M. DL2000 marker
圖3 重組質(zhì)粒十二指腸和空腸基因組擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 Results of amplification of genome from duodenum and jejunum after transfection of pSIREN-TRPV6-3

與對(duì)照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01。下同
Compared with the control group, *.P<0.05，**.P<0.01.The same as below
圖4 pSIREN-TRPV6-3轉(zhuǎn)染后十二指腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)變化
Fig.4 The mRNA expression of relative proteins in duodenum calcium transport genes after transfection of pSIREN-TRPV6-3 plasmid

圖5 pSIREN-TRPV6-3轉(zhuǎn)染后空腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)變化
Fig.5 The mRNA expression of relative proteins in jejunum calcium transport genes after transfection of pSIREN-TRPV6-3 plasmid

2.4 TRPV6基因沉默對(duì)十二指腸和空腸TRPV6和CaBP-D28K蛋白表達(dá)的影響

圖6和圖7結(jié)果顯示，在注射重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3后，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)第7、14及21天十二指腸和空腸中TRPV6和CaBP-D28K的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，其中第14天差異極顯著(P<0.01)，第28天表達(dá)有降低趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，結(jié)果與mRNA表達(dá)水平一致。

圖6 十二指腸與空腸TRPV6蛋白表達(dá)
Fig.6 Expression of TRPV6 protein in duodenum and jejunum

2.5 TRPV6基因沉默對(duì)血漿鈣、磷濃度的影響

圖8結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，TRPV6基因沉默組在不同時(shí)間點(diǎn)血漿中鈣、磷濃度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.6 TRPV6基因沉默對(duì)血漿PTH水平的影響

圖9結(jié)果顯示，TRPV6基因沉默組在轉(zhuǎn)染后第7天血漿PTH水平顯著上升(P<0.05)，在第14、21天 極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.7 TRPV6基因沉默對(duì)股骨和脛骨放射密度的影響

圖10結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3后，試驗(yàn)組蛋雞股骨和脛骨骨密度有降低趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不顯著(P>0.05)。

3 討 論

新型鈣離子通道TRPV6一直被認(rèn)為是鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)TRPV6可以在產(chǎn)蛋雞小腸、腎及蛋殼腺中發(fā)現(xiàn)TRPV6的表達(dá)，且十二指腸TRPV6的表達(dá)最為豐富[9]，提示TRPV6可能是腸鈣吸收的重要通道。

圖7 十二指腸與空腸CaBP-D28K蛋白表達(dá)
Fig.7 Expression of CaBP-D28K protein in duodenum and jejunum

圖8 血漿鈣、磷濃度的變化
Fig.8 The changes of calcium and phosphonium concentration in plasma

圖9 血漿PTH濃度變化
Fig.9 The change of PTH level in plasma

圖10 各組股骨和脛骨放射骨密度
Fig.10 Bone radiographic density of the tibia and femur in different groups

3.1 pSIREN-TRPV6-3質(zhì)粒酶切鑒定及腸道內(nèi)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證

RNA干擾技術(shù)是通過(guò)小RNA片段進(jìn)入體內(nèi)，促使mRNA快速降解，從而抑制相應(yīng)蛋白的合成，特異性阻斷基因表達(dá)。資料顯示，RNA干擾技術(shù)可用于某些疾病的治療，特別是微生物、線蟲(chóng)、動(dòng)植物等生物體功能基因的驗(yàn)證[12]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已成功構(gòu)建了TRPV6的RNA干擾質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3，本試驗(yàn)對(duì)pSIREN-TRPV6-3進(jìn)行酶切與測(cè)序鑒定，結(jié)果理想，表明重組質(zhì)粒擴(kuò)培成功，這為下一步研究體內(nèi)干擾TRPV6表達(dá)提供了可能。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)病毒方式的基因轉(zhuǎn)染的改進(jìn)做了大量的研究，但病毒載體如腺病毒載體，已證實(shí)存在安全性問(wèn)題，特別是免疫原性和細(xì)胞毒性方面[13]。相比較而言，非病毒載體無(wú)細(xì)胞毒性和免疫原性，是體內(nèi)轉(zhuǎn)染較理想的方式?；蜣D(zhuǎn)染需要一定的轉(zhuǎn)染試劑作為載體進(jìn)入細(xì)胞。目前應(yīng)用最為廣泛的是陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物，它們可透過(guò)細(xì)胞屏障，將目的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。但是，陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體內(nèi)試驗(yàn)中，會(huì)被快速清除，并誘發(fā)抗炎反應(yīng)，從而使其使用受到限制[11]。陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)，因其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可穩(wěn)定地與DNA結(jié)合，并可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，安全性高[14]，并且PEI相對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體來(lái)說(shuō)價(jià)格便宜，有利于大量的體內(nèi)試驗(yàn)，故筆者選擇更為安全的PEI作為轉(zhuǎn)染載體。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒與PEI混合溶液注射蛋雞后，在第7天就可在十二指腸和空腸檢測(cè)到較高水平的重組質(zhì)粒的表達(dá)，且可穩(wěn)定地持續(xù)至第21天。結(jié)果充分表明，本試驗(yàn)采用PEI轉(zhuǎn)染試劑和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較高，為研究TRPV6在蛋雞腸道功能的作用夯實(shí)了基礎(chǔ)。

3.2 TRPV6基因沉默對(duì)十二指腸和空腸鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

家禽的腸鈣吸收主要發(fā)生在小腸前段即十二指腸和空腸段[15]。本課題組前期研究中，成功地在蛋雞小腸組織中擴(kuò)增出TRPV6、CaBP-D28K及PMCA1b， 且TRPV6的表達(dá)量在十二指腸最高，其次是空腸，而CaBP-D28K和PMCA1b在十二指腸、空腸、回腸段表達(dá)量均較高[9]，這表明小腸是蛋雞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位。同時(shí)NCX1作為鈣離子排出細(xì)胞的第二轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，主要分布于小腸等鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)組織。本試驗(yàn)結(jié)果表明，注射pSIREN-TRPV6-3干擾質(zhì)粒，十二指腸和空腸中的TRPV6、CaBP-D28K基因和蛋白表達(dá)均顯著降低，且在第14 天抑制效果最高，PMCA1b和NCX1表達(dá)量不發(fā)生改變。表明TRPV6可以調(diào)控腸道中CaBP-D28K的表達(dá)，但不影響PMCA1b和NCX1的表達(dá)。體外研究表明TRPV6對(duì)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)作用有限[16]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，轉(zhuǎn)染TRPV6基因沉默質(zhì)粒成骨細(xì)胞TRPV6和CaBP-D28K表達(dá)降低，PMCA1b和NCX1的表達(dá)未受影響，與本研究結(jié)果一致。其他研究表明，CaBP-D9K和TRPV6單或雙敲除的小鼠，十二指腸和腎中PMCA1b表達(dá)無(wú)顯著變化[8]。綜合這些研究表明在小腸段TRPV6對(duì)CaBP-D28K具有調(diào)控作用，但是PMCA1b和NCX1表達(dá)變化不顯著。

3.3 TRPV6基因沉默對(duì)蛋雞血漿鈣、磷濃度、PTH水平及骨密度的影響

腸道對(duì)鈣離子的吸收并不能滿足蛋殼鈣化的大量鈣的需求。研究顯示，在腺胃中的食糜離開(kāi)腺胃后在約75～78 min內(nèi)，大部分的鈣離子在腸道前段被吸收[17-18]。在蛋雞腸道內(nèi)鈣離子幾乎排空的情況下，蛋殼鈣化所需的鈣離子主要是來(lái)自髓質(zhì)骨中鈣離子的轉(zhuǎn)換。這部分鈣占蛋殼總沉積鈣的20%～40%[19]。髓質(zhì)骨中缺失的鈣，主要是由腸道從日糧中吸收鈣來(lái)補(bǔ)充。故高產(chǎn)蛋雞每天蛋殼鈣化需要的鈣離子主要是來(lái)自腸道吸收。甲狀旁腺激素(PTH)是甲狀旁腺細(xì)胞分泌的，可對(duì)小腸、腎和骨等組織器官產(chǎn)生效應(yīng)，其主要作用是保持體內(nèi)鈣的平衡，調(diào)節(jié)蛋殼形成和神經(jīng)肌肉收縮等機(jī)能。本研究注射pSIREN-TRPV6-3干擾質(zhì)粒，血漿鈣、磷濃度未發(fā)生改變，PTH水平升高，與腸道TRPV6和CaBP-D28K表達(dá)正好相反，在第14天顯著降低，表明腸道TRPV6基因沉默后，機(jī)體通過(guò)動(dòng)員PTH等鈣調(diào)激素分泌，作用于腎和骨骼的代償機(jī)制可保證正常的血鈣水平。蛋殼鈣一部分來(lái)源于白天腸道對(duì)日糧鈣的吸收，一部分來(lái)源于夜間髓質(zhì)骨中鈣離子的轉(zhuǎn)換，而髓質(zhì)骨中缺失的鈣，也主要是由腸道從日糧中吸收鈣來(lái)補(bǔ)充，而一旦腸道鈣離子吸收障礙，極易導(dǎo)致髓質(zhì)骨中鈣含量下降，骨質(zhì)疏松、骨折等疾病的發(fā)生，本研究中股骨和脛骨密度沒(méi)有變化，提示以TRPV6為“門控”通道的鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)可能不是調(diào)控蛋雞腸道鈣離子吸收的主要途徑，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

高產(chǎn)蛋雞在肌肉注射pSIREN-TRPV6-3干擾質(zhì)粒后，在十二指腸和空腸部位成功轉(zhuǎn)染，顯著抑制腸道TRPV6和CaBP-D28K的表達(dá)，在轉(zhuǎn)染后第14天到達(dá)作用頂峰，但不影響腸道PMCA1b和NCX1表達(dá)及血鈣、血磷濃度，血液PTH水平代償性提高。綜合分析，TRPV6能調(diào)控腸道CaBP-D28K蛋白表達(dá)，但在正常日糧鈣水平條件下，沉默TRPV6通道蛋白不影響蛋雞體內(nèi)正常的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)。