細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴microRNA表達(dá)譜分析

王正榮，薄新文*，張艷艷，馬 勛，盧平萍，，徐夢(mèng)飛,，孟季蒙

(1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石河子 832000； 2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000)

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的內(nèi)源性小RNA分子，其長(zhǎng)度在22個(gè)核苷酸左右。它們?cè)趧?dòng)植物體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，并且通過(guò)部分或者全部序列互補(bǔ)的形式結(jié)合到靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子上，直接導(dǎo)致其降解或翻譯受阻[1-6]。截至目前，在miRBase (http://www. Mirbase. org/ release 22.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)提交的miRNA序列已經(jīng)達(dá)到271個(gè)物種的48 885條成熟序列。已提交的棘球?qū)俳{蟲的miRNA 成熟序列147條，其中細(xì)粒棘球絳蟲的miRNA序列為133條。

包蟲病是由棘球?qū)儆紫x——棘球蚴寄生于中間宿主牛、羊等動(dòng)物以及人類，引起嚴(yán)重的臟器損傷，是一種危害性極其嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病[7-8]。該病是導(dǎo)致我國(guó)西部農(nóng)牧區(qū)牧民因病致貧、因病返貧的主要原因之一。目前，該病呈世界性分布，我國(guó)20省份有該病發(fā)生，主要流行于西部一些牧區(qū)，包括青海、西藏、新疆等地。據(jù)估計(jì)國(guó)內(nèi)包蟲病的患者人數(shù)35萬(wàn)～130萬(wàn)[7]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)包蟲病的受威脅人口近5 000萬(wàn)，患者數(shù)量龐大，與現(xiàn)有的全球包蟲病流行數(shù)據(jù)相比較，顯示我國(guó)包蟲病受威脅人口數(shù)和患者數(shù)仍居全球首位[7, 9]。該病嚴(yán)重危害著疫區(qū)群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全，同時(shí)也嚴(yán)重影響著我國(guó)的國(guó)際聲譽(yù)。

細(xì)粒棘球絳蟲是包蟲病的主要病原之一，其原頭蚴具有雙向發(fā)育的特性，即在中間宿主體內(nèi)原頭蚴可經(jīng)無(wú)性繁殖發(fā)育為包囊，在終末宿主體內(nèi)，原頭蚴可經(jīng)有性繁殖發(fā)育為成蟲。這一發(fā)育現(xiàn)象必然受到眾多因素的調(diào)控，已有研究報(bào)道在原頭蚴發(fā)育為成蟲的過(guò)程中，膽酸鹽信號(hào)通路發(fā)揮著重要的功能[10]。但有沒有其他的調(diào)控因子(如非編碼RNA等)不得而知，為了進(jìn)一步揭示miRNA在原頭蚴發(fā)育中調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴表達(dá)的miRNA進(jìn)行了測(cè)序研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的新miRNA分子，這些發(fā)現(xiàn)一方面豐富了細(xì)粒棘球絳蟲miRNA數(shù)據(jù)，另一方面為揭示miRNA在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在新疆石河子市牛、羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)采集細(xì)粒棘球蚴感染的綿羊肝，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，先用高壓滅菌的生理鹽水將臟器表面清洗干凈，然后用酒精棉球?qū)εK器表面做消毒處理，無(wú)菌注射器吸取囊液，于無(wú)菌條件下剪開包囊的頂部取出內(nèi)囊，置于一無(wú)菌平皿中，用加雙抗的無(wú)菌PBS液反復(fù)吹打沖洗3～5次，收集蟲體沉淀，備用。

1.2 總RNA的提取、miRNA庫(kù)的建立以及測(cè)序

按照Trizol(Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA)法提取約100 mg的細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)總RNA，柱純化后用Nanodrop ND-1000(Nanodrop Nechnologies，Wilmington，DE)分析濃度，用Agilent BioAnalyzer 2100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)?？俁NA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

首先，采用15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(PAGE)從總RNA中分離小片段15～30 nt RNA，純化后對(duì)小片段RNA連接3′和5′接頭。然后運(yùn)用SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶將連接有5′和3′接頭的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，并使用下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s、60 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸15 s，14個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增后的cDNA經(jīng)純化檢測(cè)合格后，送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序。

1.3 保守與新miRNA的鑒定

對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量、污染、接頭的處理，然后統(tǒng)計(jì)序列總數(shù)、種數(shù)和長(zhǎng)度，最后獲得全部有效序列用作后續(xù)分析。首先將有效序列比對(duì)到GenBank、Repeat sequence、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)，去除rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、repeat等非編碼小RNAs；然后將剩余序列比對(duì)到miRBase 21.0中已知miRNA的成熟序列或前體序列(默認(rèn)G-U配對(duì)，允許1～2個(gè)堿基錯(cuò)配)，從而得到在細(xì)粒棘球絳蟲已知的miRNA；最后將剩余序列比對(duì)到細(xì)粒棘球絳蟲EST數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)截取與小RNA匹配的50～70 bp 的EST序列，利用Mireap軟件預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲特有的miRNA。

1.4 miRNA靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)

利用Miranda算法[11-12]預(yù)測(cè)miRNA靶基因，該算法采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法搜索miRNA與 3′ UTR互補(bǔ)同時(shí)穩(wěn)定形成雙鏈的區(qū)域，預(yù)測(cè)miRNA靶基因過(guò)程中所使用到的閾值參數(shù)為：S≥150，Δ G≤-126 kJ·mol-1，同時(shí)必須滿足5′端種子序列的配對(duì)。

1.5 wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA及其潛在靶標(biāo)基因在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴體外培養(yǎng)不同時(shí)間的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析

1.5.1 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的體外培養(yǎng)及總RNA的提取cDNA合成 將無(wú)菌采集的細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴按2 000枚·mL-1的培養(yǎng)密度接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640為主的培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)0、4、10 d采集樣品，保存于液氮中，備用?？俁NA提取采用Invitrogen Trizol Reagent試劑，提取方法參照試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行。mRNA和miRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA合成分別采用康為世紀(jì)公司10 μL反轉(zhuǎn)錄體系的CW2582和CW2141S試劑盒。

1.5.2 miRNA熒光定量 采用康為世紀(jì)公司CW2142S試劑盒推薦的20 μL熒光定量反應(yīng)體系。加入2× miRNA qPCR Mixture 10 μL，10 μmol·L-1Forward primer 0.4 μL，10 μmol·L-1Reverse primer 0.4 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件依據(jù)引物退火溫度而略有不同，PCR程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.5.3 mRNA的熒光定量 提取體外培養(yǎng)0、4和10 d的原頭蚴組織樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上述cDNA為模板，以efa為內(nèi)參基因，對(duì)miRNA靶標(biāo)基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：SYBR PremixExTaqMix(2×) 10 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.4 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因做三個(gè)重復(fù)，采用相對(duì)比較△Ct(Qr=2-△△Ct)[13]法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。mRNA的定量PCR采用的內(nèi)參基因是efa，miRNA 定量PCR采用的內(nèi)參基因是5.8S，引物序列參見表1。

表1定量PCR檢測(cè)引物

Table1Primersusedinthisstudy

基因Genes引物序列(5′→3′)Primers sequencesaxinForwardTGATCACTTACCTCCGCCTCReverseGAGTGGCATTTCTCTCAGCGdisForwardAGCTCCACTTCAACCTCCTCReverseCGGTTGAGACGTAGAATGCGβ-cateninForwardTGTCACGCAAAGGAGGAGATReverseGGGATTATGTGGCGGTTGACefaForwardATGAAGCCGGGTATGATCGTReverseTAACTTGGGCGGTGAACTCT36258ForwardTAGACGCCGCAAGCGCGTA36364ForwardGCTGCAGGCCGGAAATT25846ForwardACGCGAGATTTGGTTTGTCCTCReverseOffered by miRNA q-PCR assay kit (CW2142s; Beijing ComWin Biotech Co., Ltd)5.8SForwardTCGATGAAGAGTGCAGCCGACReverseATGCGTTCGAAGTGTCGATGTT

1.6 wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA潛在靶標(biāo)基因在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的組織分布

根據(jù)miRNA靶基因的序列設(shè)計(jì)熒光原位雜交探針，探針由廣州外顯子生物技術(shù)有限公司合成。全量組織熒光原位雜交的操作流程主要參照Olson實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站(http://www.olson lab.com/)公開的操作方法以及參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行[14]，主要包括樣品的固定、蛋白酶處理、預(yù)雜交、雜交、復(fù)染等過(guò)程。

2 結(jié) 果

2.1 Small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理

筆者總共從細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)得到22 752 526 條reads序列，在去除低質(zhì)量的reads序列和接頭序列后，最終還剩21 708 040條潔凈序列，其中細(xì)粒棘球絳蟲特有序列1 172 539條。這些潔凈reads序列的長(zhǎng)度大多集中在21～23 nt之間(圖1)，此結(jié)果提示本研究建立的小RNA文庫(kù)中含有豐富的miRNA序列。除miRNA外，在文庫(kù)中還鑒定到其他一些小RNA的序列，如rRNAs、tRNAs、snRNAs和snoRNAs，并且rRNAs和tRNAs在文庫(kù)中占有較高的比例。

圖1 原頭蚴small RNA reads長(zhǎng)度的分布
Fig.1 The length distribution of reads for small RNA in protoscoleces

2.2 序列比對(duì)注釋

2.2.1 參考基因組比對(duì) 將潔凈的reads序列首先與細(xì)粒棘球絳蟲參考基因組進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，比對(duì)到參考基因組上的reads序列為16 828 531 條，占全部reads總數(shù)的77.52%，其中細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴特異的reads數(shù)為529 664個(gè)，占總數(shù)的45.17%。

2.2.2 miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRNABase數(shù)據(jù)庫(kù))比對(duì)注釋 采用Bowtie軟件將序列與miRNABase中該miRNA成熟體序列進(jìn)行無(wú)錯(cuò)配比對(duì)，比對(duì)上的序列認(rèn)為是已知的miRNA。結(jié)果顯示有7 505 269個(gè)reads序列可以比對(duì)到miRNABase數(shù)據(jù)庫(kù)，占總數(shù)的34.57%，其中細(xì)粒棘球絳蟲特異性序列650條，占總數(shù)的0.05%。

和細(xì)粒棘球絳蟲現(xiàn)已公布的227個(gè)已知miRNA 分子序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中，存在121個(gè)已知的miRNA序列，但經(jīng)過(guò)比對(duì)后有109個(gè)miRNA表達(dá)。其中相對(duì)表達(dá)量處于前10位的miRNA分子如下：egr-miR-10、egr-let-7、egr-bantam、egr-miR-71、egr-miR-2b、egr-miR-4989、egr-miR-61、egr-miR-125、egr-miR-3479和egr-miR-2a，見表2。

表2細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中表達(dá)量前10的已知的miRNA分子

Table2TherelativeabundanceofthetoptenhighestexpressedknownmaturemiRNAsinPSCofE.granulosus

miRNA名稱Name of miRNA表達(dá)量Expression levelegr-miR-103 439 042egr-let-72 085 925egr-bantam982 374egr-miR-71273 283egr-miR-2b103 300egr-miR-498983 696egr-miR-6182 295egr-miR-12551 371egr-miR-347951 269egr-miR-2a43 385

2.3 新miRNA預(yù)測(cè)

2.3.1 新miRNA的預(yù)測(cè) 采用miRDeep2軟件結(jié)合該物種同源的miRNA 序列、RNAfold等RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)識(shí)別新miRNA的成熟體(star miRNA與mature miRNA)和前體序列。針對(duì)每個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA，miRDeep2軟件采用各種評(píng)價(jià)方法評(píng)估其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示共預(yù)測(cè)出189條新的miRNA發(fā)夾前體，其中含有189個(gè)mature 序列和189個(gè)star序列，但經(jīng)過(guò)比對(duì)后只有260個(gè)miRNA有表達(dá)。其中相對(duì)表達(dá)量處于前10位 的novel miRNA分別為HG328392.1_6805、HG328414.1_36428、HG328424.1_38644*、HG328465.1_42151、HG328457.1_41721*、HG328407.1_34056、HG328397.1_22187、HG328392.1_10888*、HG328393.1_11978和HG328391.1_3385*，見表3。

表3細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中表達(dá)量前10的新的miRNA分子

Table3TherelativeabundanceofthetoptenhighestexpressednovelmiRNAsinPSCofE.granulosus

miRNA名稱Name of miRNA表達(dá)量Expression levelHG328392.1_680516 122HG328414.1_3642810 952HG328424.1_38644?10 134HG328465.1_421517 269HG328457.1_41721?2 234HG328407.1_340561 077HG328397.1_22187893HG328392.1_10888?548HG328393.1_11978520HG328391.1_3385?385

2.3.2 新的miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)RNAfold等RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)識(shí)別新miRNA的成熟體(star miRNA與mature miRNA)和前體序列。結(jié)果顯示本研究測(cè)序獲得的novel miRNA都具有典型的hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)(如圖2所示)，本研究預(yù)測(cè)了wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)的3個(gè)miRNA，即HG328399.1_25846、HG328414.1_36364*和HG328413.1_36258的二級(jí)結(jié)構(gòu)，見圖2A～C。

2.4 miRNA靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)

根據(jù)miranda軟件預(yù)算法則，本研究對(duì)測(cè)序獲得的細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴miRNA潛在的靶標(biāo)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示已知的109個(gè)miRNA共預(yù)測(cè)得到132個(gè)潛在的靶標(biāo)基因。對(duì)260個(gè)有表達(dá)的新鑒定得到的miRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，有3 152個(gè)潛在的靶標(biāo)基因。同時(shí)本研究還對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)wnt以及膽酸鹽信號(hào)通路相關(guān)的miRNA進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示與上述信號(hào)通路潛在互作的miRNA分子分別為30個(gè)和13個(gè)，其具體的互作關(guān)系如圖3、圖4所示。

2.5 wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA的篩選及qPCR驗(yàn)證

采用qPCR方法對(duì)軟件預(yù)測(cè)的wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA以及靶標(biāo)基因在原頭蚴體外培養(yǎng)0、4、10 d的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，β-catenin基因在原頭蚴體外培養(yǎng)0、4、10 d的過(guò)程中其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈逐漸下降的趨勢(shì)，其對(duì)應(yīng)的miRNAHG328413.1_36258的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，dis以及axin基因在原頭蚴體外培養(yǎng)0、4、10 d的過(guò)程中其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈逐漸升高的趨勢(shì)， 而其對(duì)應(yīng)的miRNAHG328414.1_36364* 和HG328399.1_25846的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，見圖5。

2.6 wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA潛在靶標(biāo)基因在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的組織分布

對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)miRNA潛在靶標(biāo)基因的全量組織原位雜交分析結(jié)果表明，β-catenin、axin以及dis基因在原頭蚴頂突的口鉤部位均有分布，除此之外，β-catenin和axin基因在蟲體原頭蚴散在的細(xì)胞中也有表達(dá)，見圖6。

3 討 論

2011年，Cucher等[15]首次在細(xì)粒棘球絳蟲中鑒定得到了38種microRNA，其中16種和其他后生動(dòng)物同源，18種和更低等的生物同源，還有4種可能是棘球?qū)俳{蟲特有的。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，這些microRNA在蟲體不同發(fā)育階段的表達(dá)存在差異，提示其功能可能與發(fā)育相關(guān)。近年，Bai等[16]對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲3個(gè)不同發(fā)育階段(即成蟲、幼蟲以及包囊)的microRNA進(jìn)行了檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)了94個(gè)前體序列，編碼91個(gè)成熟的miRNA和39個(gè)miRNA stars。

圖2 HG328399.1_25846(A)、HG328414.1_36364*(B)和HG328413.1_36258(C)發(fā)卡結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
Fig.2 Hairpin structure prediction of HG328399.1_25846(A)、HG328414.1_36364*(B) and HG328413.1_36258(C)

圖3 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中wnt信號(hào)通路相關(guān)miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)
Fig.3 The miRNA-mRNA networks related wnt signaling pathway of protoscoleces in E. granulosus

圖4 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中膽酸鹽信號(hào)通路相關(guān)miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)
Fig.4 The miRNA-mRNA networks related bile-salt signaling pathway of protoscoleces in Echinococcus granulosus

研究發(fā)現(xiàn)有些miRNA是組織特異性表達(dá)的，提示其可能與蟲體特有組織的發(fā)育相關(guān)。其中還有42個(gè)miRNA在不同發(fā)育階段差異表達(dá)，推測(cè)其可能與蟲體雙向發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)粒棘球絳蟲中，30個(gè) 保守的miRNAs家族中的很多成員都存在缺失，這可能與蟲體較低的復(fù)雜性以及較高的適應(yīng)性相關(guān)[17]。

已有的研究表明，一些棘球?qū)俚膍iRNAs在脊椎動(dòng)物宿主中是缺失的，這些miRNAs可能是棘球絳蟲特有的，提示這些分子也許可以作為疾病診斷的潛在靶標(biāo)。起初有研究者在宿主血清中檢測(cè)到曼氏血吸蟲的miRNAs分子，包括miR-277 和bantam，由于這些miRNAs分子在未感染的宿主中并不存在，因此可以作為血吸蟲病檢測(cè)的靶標(biāo)基因[18]。無(wú)獨(dú)有偶，之后又有研究者分析發(fā)現(xiàn)了一些棘球?qū)俳{蟲特有，而宿主缺失的miRNAs，包括miR-71、miR-4989 (miR-277家族) 和bantam，或者是一些由宿主同源的分子分化而來(lái)的分子，諸如let-7等，也可作為包蟲病診斷的潛在靶標(biāo)基因[19]。

a. HG328413.1_36258 vs β-catenin; b. HG328414.1_36364* vs dis; c. HG328399.1_25846 vs axin
圖5 miRNA和候選靶基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析
Fig.5 The relative transcription of miRNA and their candidate targets genes

H.口鉤;C.散在的細(xì)胞。陽(yáng)性雜交結(jié)果呈綠色，細(xì)胞核呈紅色
H. Hooks; C. Disperse cells. The positive results of Whole-mount in situ hybridization signal is shown in green and nuclear PI staining in red
圖6 β-catenin、dis和axin基因在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的原位雜交分析
Fig.6 The results of β-catenin，dis and axin in E. granulosus protoscoleces in situ hybridization

這一研究結(jié)論在后期的研究中又得到了進(jìn)一步的佐證，有學(xué)者在感染多房棘球絳蟲的小鼠血清中檢測(cè)到2種蟲體特異性的miRNAs，包括miR-10和miR-227[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中，存在109個(gè)已知的miRNA序列，其中表達(dá)量相對(duì)較高的有egr-bantam、egr-let-7、egr-miR-10、egr-miR-125、egr-miR-190、egr-miR-2162、egr-miR-2a、egr-miR-2b、egr-miR-3479、egr-miR-4989、egr-miR-4989*、egr-miR-61和egr-miR-71?？梢钥闯銮懊嫜芯繄?bào)道的棘球?qū)偬赜械膍iRNA分子諸如miR-71、miR-4989、miR-277和bantam等同樣存在于細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，且表達(dá)量較高。除此之外，本研究從細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴中分離得到189個(gè)新的成熟序列和189個(gè)star序列，后經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，只有260個(gè)miRNA有表達(dá)。為了更好地理解miRNA在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的調(diào)控作用，本研究分析了與動(dòng)物機(jī)體5大信號(hào)通路(即wnt、cAMP、Hedgehog、NF-κB 和Notch信號(hào)通路)相關(guān)的miRNA分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與上述信號(hào)通路潛在互作的miRNA分子分別為30、34、14、6和13個(gè)，其中已知的miRNA分子有egr-miR-4990、egr-new-125和egr-miR-125，其余均為本研究新發(fā)現(xiàn)的miRNA分子。由于細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴具有雙向發(fā)育性，并且已有的研究已證實(shí)，在原頭蚴發(fā)育為成蟲的過(guò)程中受到膽酸鹽信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。因此，本研究同樣分析了與膽酸鹽信號(hào)通路存在潛在互作的miRNA分子，發(fā)現(xiàn)有13個(gè)miRNA分子可能參與調(diào)控此信號(hào)通路，且均為新發(fā)現(xiàn)的miRNA分子。

經(jīng)典的wnt信號(hào)通路，即wnt/β-catenin為動(dòng)物體軸發(fā)育關(guān)鍵的信號(hào)通路[21-22]。前期的研究表明，細(xì)粒棘球絳蟲具有完整的wnt信號(hào)通路主要成員[23]。本研究采用miranda軟件預(yù)測(cè)了與wnt/β-catenin信號(hào)通路主要基因互作的miRNA分子，結(jié)果顯示有12個(gè)miRNA分子，文庫(kù)編號(hào)為HG328403.1_31513*、HG328429.1_39208*、HG328392.1_10158、HG328392.1_6661、HG328399.1_25562、HG328396.1_20495、HG328408.1_34466*、HG328395.1_18164*、HG328399.1_25846、HG328413.1_36258、HG328414.1_36364*和HG328392.1_7008，其潛在的靶基因分別為wnt2、frizzled5、LRP、β-catenin、GSK-3β、dis和axin，后經(jīng)qPCR驗(yàn)證表明，僅有HG328413.1_36258和β-catenin、HG328414.1_36364*和dis以及HG328399.1_25846和axin其表達(dá)趨勢(shì)相反，存在潛在的調(diào)控關(guān)系。之后筆者又采用全量組織原位雜交技術(shù)分析了這三個(gè)潛在靶標(biāo)基因的組織分布規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要分布于細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴頂突的口鉤、內(nèi)部散在的細(xì)胞以及表皮部位。

4 結(jié) 論

對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴表達(dá)的miRNA進(jìn)行了測(cè)序研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的新miRNA分子，通過(guò)對(duì)這些miRNAs靶基因預(yù)測(cè)以及初步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這些非編碼的小分子可能廣泛參與細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步揭示miRNA在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。