辛伐他汀對(duì)帕金森病大鼠的治療作用及其作用機(jī)制

陳 冬，歐陽(yáng)存，張淑琴，鄧立軍，胡 昉

(江漢大學(xué)附屬武漢市第六醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 430015)

帕金森病(parkinson disease,PD)主要是因中腦黒質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失而誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。但現(xiàn)階段PD的發(fā)病機(jī)制尚不明晰[1]。多巴胺受體激動(dòng)劑替代療法是現(xiàn)階段治療PD的重要方法，雖可在一定程度上緩解PD臨床癥狀，但無(wú)法阻止PD病程的進(jìn)展[2]。此外，該類(lèi)藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用還可誘發(fā)多種不良反應(yīng)。以辛伐他汀為代表的他汀類(lèi)藥物是高脂血癥臨床治療的重要藥物，具有抗氧化、改善內(nèi)皮功能、抗增生、抗炎、抗凝和穩(wěn)定斑塊等多種作用[3]，可透過(guò)血腦屏障，在臨床上被廣泛用于降低血漿膽固醇水平。最新的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀還可通過(guò)神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)發(fā)揮治療神經(jīng)變性疾病的作用[4]。然而，關(guān)于辛伐他汀對(duì)神經(jīng)退行性疾病的影響和機(jī)制還未被完全闡明。本研究旨在探討辛伐他汀對(duì)PD大鼠的治療作用及其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取SD雄性成年大鼠54只，體質(zhì)量220～250 g，平均(234.1±8.2)g，光照間隔時(shí)間12 h、相對(duì)濕度45%～60%、溫度23～25 ℃、自由進(jìn)食進(jìn)水。(2)實(shí)驗(yàn)儀器與藥品：阿普嗎啡、脂多糖(LPS)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所；抗離子鈣結(jié)合蛋白1和酪氨酸羥化酶購(gòu)于美國(guó)R&D公司；兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)于南京凱基生物有限公司；大鼠定位儀購(gòu)于上海高鴿公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組、造模及處理方法 選取SD雄性成年大鼠54只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、治療組各18只，模型組和治療組采用LPS誘導(dǎo)法建立PD大鼠模型，大鼠立體定位黑質(zhì)區(qū)2 μL LPS注射(5 μg/μL)；對(duì)照組大鼠黑質(zhì)區(qū)注射等量生理鹽水。治療組分別于造模前1 h及造模后每天17點(diǎn)腹腔注射辛伐他汀5 mg/kg，連續(xù)14 d，模型組和對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射[5]。

1.2.2觀察指標(biāo) (1)行為學(xué)觀察方法：大鼠連續(xù)給藥14 d后，腹腔注射阿普嗎啡0.05 mg/kg，記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和方向；以大鼠后右側(cè)肢為支點(diǎn)，毀損對(duì)側(cè)開(kāi)始旋轉(zhuǎn)，5 min記錄1次，連續(xù)觀察30 min[6]。(2)Western blot檢測(cè)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)：行為學(xué)觀察結(jié)束第2天，大鼠斷頭處死，冰凍切片機(jī)取黑質(zhì)區(qū)，稱重后裂解液勻漿并離心取上清液；BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；蛋白質(zhì)樣品(50 μg)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，2 h脫脂奶粉封閉后加入一抗并4 ℃過(guò)夜；加入二抗后搖床2 h孵育，轉(zhuǎn)至PVDF膜上DAB顯色[7]。(3)ELISA檢測(cè)各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平：大鼠斷頭處死，冰凍切片機(jī)取黑質(zhì)區(qū)，稱重后裂解液勻漿并離心取上清液，檢測(cè)CRP、TNF-α、IL-6水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(4)免疫組織化學(xué)(IHC)染色：取大鼠黑質(zhì)區(qū)和紋狀體，石蠟切片后抗離子鈣結(jié)合蛋白抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白及酪氨酸羥化酶IHC染色法檢測(cè)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體(TrKB)、神經(jīng)肽Y(NPY)的表達(dá)，最后結(jié)果使用Image-Pro圖形軟件進(jìn)行分析[8]。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學(xué)觀察 對(duì)照組、模型組、治療組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)分別為(2.80±1.10)、(154.20±13.80)、(87.60±10.30)圈/分，治療組和模型組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)，而治療組的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯少于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠血清炎癥因子水平比較 治療組和模型組大鼠的血清CRP、TNF-α、IL-6明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而治療組的血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05)；見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)水平比較 對(duì)照組、模型組、治療組大鼠黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)水平分別為(0.22±0.08)、(0.65±0.12)、(0.42±0.10)/NADPG%，治療組和模型組大鼠的黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而治療組的黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)強(qiáng)度水平明顯低于模型組(P<0.05)。

2.4各組大鼠黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY表達(dá)水平比較 治療組和模型組大鼠的黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而治療組的黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY水平明顯高于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY表達(dá)水平

a:P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與模型組比較

3 討 論

PD是一類(lèi)神經(jīng)退行性疾病，臨床癥狀多樣，存在認(rèn)知功能障礙、疲勞癥狀等非運(yùn)動(dòng)癥狀及部分運(yùn)動(dòng)癥狀。但由于PD相關(guān)機(jī)制尚未明晰，導(dǎo)致現(xiàn)階段臨床缺乏有效的治療手段。有研究已證實(shí)辛伐他汀等他汀類(lèi)藥物可以在改善神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮顯著的治療作用[9]，但目前對(duì)其神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物可經(jīng)過(guò)免疫分子機(jī)制降低對(duì)神經(jīng)元的損傷進(jìn)而改善癡呆的臨床表征[10]；張陽(yáng)等[11]通過(guò)多項(xiàng)臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)他汀類(lèi)藥物從分子層面進(jìn)行了總結(jié)，認(rèn)為其具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多項(xiàng)功能，進(jìn)而降低PD、腦血管病和癲癇等神經(jīng)性疾病的發(fā)病率。本研究通過(guò)LPS建立大鼠PD模型，探討辛伐他汀對(duì)PD大鼠的治療作用及其作用機(jī)制，希望能夠?yàn)榕R床PD的治療提供數(shù)據(jù)參考。本研究結(jié)果顯示治療組和模型組大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)，而治療組的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)。該結(jié)果從行為學(xué)角度研究認(rèn)為辛伐他汀能明顯改善PD大鼠的臨床表征。

有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的退行性病變與TNF-α和炎癥因子具有密切聯(lián)系，并認(rèn)為T(mén)NF-α與IL-6的表達(dá)可損傷DA神經(jīng)[12]。CRP是機(jī)體非特異性免疫機(jī)制的一部分，可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬作用，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞或單核/巨噬系統(tǒng)功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞組織因子的生成[13]。本研究發(fā)現(xiàn)治療組和模型組大鼠的血清CRP、TNF-α、IL-6明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，治療組的血清CRP、TNF-α、IL-6水平明顯低于模型組(P<0.05)。該結(jié)果提示辛伐他汀可通過(guò)炎性反應(yīng)水平改善PD大鼠的臨床癥狀。

SHALBAY等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AD、PD等多種疾病和神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷均存在iNOS的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)治療組和模型組大鼠的黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，治療組的黑質(zhì)區(qū)iNOS表達(dá)強(qiáng)度水平明顯低于模型組(P<0.05)。上述結(jié)果提示辛伐他汀可通過(guò)對(duì)激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。治療組和模型組大鼠的黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，但治療組的黑質(zhì)區(qū)BDNF、TrKB、NPY水平明顯高于模型組(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明辛伐他汀可通過(guò)改善BDNF、TrKB、NPY的活性達(dá)到治療PD大鼠的效果。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，TrKB受體可通過(guò)自動(dòng)磷酸化與配體BDNF共價(jià)結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；軸突切斷后，脊髓內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可出現(xiàn)TrKBmRNA表達(dá)增加[15]，提示BDNF有可能通過(guò)其受體TrKB受體發(fā)揮再生與存活效應(yīng)。

綜上所述，辛伐他汀能明顯降低PD大鼠的炎性反應(yīng)水平、改善BDNF、TrKB、NPY的活性及降低iNOS表達(dá)，從而達(dá)到治療PD大鼠的效果。