基于超高效液相色譜分析黃連、吳茱萸配伍藥對的有效成分

虞文妹 周寶玉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院中藥房，南京，213161)

藥對又名對藥，是醫(yī)師在長期的臨床疾病診療過程歸納和總結(jié)出來的寶貴用藥經(jīng)驗，是臨床用藥復(fù)方的最小配伍單位[1]。藥對配伍一直是傳統(tǒng)中藥學(xué)的主要組成部分，歷代醫(yī)家對其十分重視，并一直在進(jìn)行研究和改進(jìn)；通過不同形式的配伍使用，藥對或可通過相須、相使的作用以增強(qiáng)療效、并對主藥提供相輔作用而增強(qiáng)療效，使方中諸藥直達(dá)病所；或可通過相畏相殺而對組方中的藥物進(jìn)行相互制約而降低藥物的不良反應(yīng)[2-4]。黃連和吳茱萸的配伍使用由來已久，歷朝歷代均多有記載，《丹溪心法》中將其配伍6∶1使用，用以治療肝火犯胃，這體現(xiàn)寒熱配伍使用的經(jīng)典藥對組合[5]。黃連是多年生草本植物，為毛莨科黃連屬，最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其根莖呈連珠狀而色黃，故而謂之，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬、具有散熱止痛、降逆止嘔之功效。通過相似度評價對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，分析指紋圖譜中的有效信息，建立相對應(yīng)的指紋圖譜，以期為黃連和吳茱萸藥的物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍機(jī)制和臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜(UPLC)儀(型號：ACQUITY，美國Waters公司)，質(zhì)譜檢測器(型號：Xevo TQ，美國Waters公司)。

1.2 試劑 研究中購于中國食品藥品檢定研究院的對照品有鹽酸小檗堿(110713-201212)，鹽酸巴馬汀(110732-201309)，鹽酸藥根堿(110733-201108)，吳茱萸堿(110802-201409)，吳茱萸次堿(110801-201207)，吳茱萸內(nèi)酯(110800-201205)；購于上海純優(yōu)生物科技有限責(zé)任公司的對照品有黃連堿(3486-66-6)，表小檗堿(6873-09-2)。乙腈色譜純、甲酸色譜純、純水均購于上海睿鷹生物科技有限公司。

1.3 分析樣品 不同產(chǎn)地的黃連-吳茱萸配伍藥對，藥對配伍比例均按照《丹溪心法》中6∶1的比較，研究共選擇4種不同來源，樣品1(S1)重慶石柱黃連和江西樟樹吳茱萸，樣品2(S2)四川峨眉山黃連和貴州印江吳茱萸，樣品3(S3)湖北利川黃連和浙江磐安吳茱萸，樣品4(S4)貴州羊昌黃連和貴州金沙吳茱萸；各藥對樣品均研磨成粉代用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 選用ACQUITY UPLC BEH C18作為本次研究的色譜柱(1.7 μm，100 mm×2.1 mm)，柱溫為40 ℃；加入2 μL 10 ℃的樣品后，以乙腈(流動相A)-純水加0.05% 甲酸(流動相B)，流速為0.4 mL/min進(jìn)行梯度洗脫，具體梯度洗脫程序。見表1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量1.2中所有的對照品，用100%甲醇溶解并制成混合對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序

2.3 供試品溶液的制備 以3號篩篩取并精密稱量1.3樣品粉末0.2 g于錐形瓶中，用50 mL 100%甲醇進(jìn)行溶解，為加速溶解進(jìn)程，可先浸泡1 h后再采用超聲法30 min，超聲期間搖勻溶液，待冷卻后用0.22 μm的微孔濾膜濾過，制成供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液各5 μL，采用薄層層析方法(TLC)對黃連、吳茱萸配伍藥對進(jìn)行專屬性試驗，分別點與同一片硅膠G薄層色譜板，經(jīng)過展開后，晾干硅膠G薄層色譜板，噴上含有2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，加熱100 ℃，5 min后將色譜板放置于365 nm的紫外光燈下觀察，專屬性試驗結(jié)果顯示黃連、吳茱萸配伍藥對的專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液20 μL，進(jìn)行UPLC反應(yīng)并以混合對照品進(jìn)樣量(μ g)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，黃連回歸方程為Y=3310.8X+83.44，相關(guān)系數(shù)為0.9995，線性范圍為0.086～2.775；吳茱萸回歸方程為Y=13736X+2.18，相關(guān)系數(shù)為0.9997，線性范圍為0.0041～0.1326。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示平均RSD(相對標(biāo)注偏差)是1.8%，儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、12 h后進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示平均RSD是1.8%，試驗條件穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同UPLC儀器和色譜條件上檢測5次，結(jié)果顯示平均RSD為1.9%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品溶液，進(jìn)行回收率試驗測定，計算結(jié)果顯示平均回收率為99.6%，RSD為1.4%。

2.10 樣品測定結(jié)果

2.10.1 指紋圖譜 在黃連、吳茱萸配伍藥對的對照指紋圖譜和樣品指紋圖譜的比較中，研究根據(jù)相對保留時間標(biāo)定16個較有特征的共有峰；這16個共有峰分別與單味黃連藥物及單味吳茱萸的指紋圖譜特征峰比較，發(fā)現(xiàn)9、15和16號共有峰是黃連、吳茱萸都存在的特征峰，而1、2、13、14號共有峰僅吳茱萸方有的特征峰，余下共有峰為黃連藥物的特征峰。見圖1和圖2。

圖1 黃連、吳茱萸配伍藥對的對照指紋圖譜

圖2 黃連、吳茱萸配伍藥對的樣品指紋圖譜

2.10.2 黃連、吳茱萸配伍藥對有效成分鑒定 研究采用UPLC和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合分析黃連、吳茱萸配伍藥對的有效成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示如表2，其中9、15和16號黃連、吳茱萸配伍藥對共有的特征峰，在結(jié)合質(zhì)譜分析和化合物質(zhì)裂解規(guī)律，推測出木蘭花堿、格陵蘭黃連堿和1-甲基-2壬基-4(1H)-奎若酮等3中化合物。

表2 黃連、吳茱萸配伍藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)及有效成分鑒定

3 討論

3.1 提取的優(yōu)化分析 分別通過以下條件的比較分析，包括:1)提取溶劑[6-9]：提取溶劑需要根據(jù)中藥各成分在溶劑中的溶解性而選擇，溶解劑必須最大限度溶劑研究所需的有效成分而對不需要的成分僅有最小溶解度，溶解劑選擇中一般以強(qiáng)極性溶解劑水為首要考慮，其次根據(jù)所提取成分的親水性和親脂性而選擇不同的溶劑，在本研究中嘗試以親水性大于親脂性的甲醇和乙醇，不同比例甲醇(25%、50%、75%、100%)、乙醇、水進(jìn)行前期研究，尋找最佳提取濃度和比例，結(jié)果顯示100%甲醇的提取率和提取純度最高；2)提取方法主要有冷提和熱提2組方法[10-13]，其中超聲、微波、加熱回流、煎煮等屬于熱提法，最終發(fā)現(xiàn)超聲法提取過程中無需中途過濾，且使用的溶劑量最少，最大限度節(jié)約研究時間和研究成本；因此在超高效液相色譜(UPLC)檢測研究中，對色譜峰數(shù)、峰形、峰面積、分離度、基線指標(biāo)進(jìn)行分析后，最后將甲醇作為最后的提取溶劑，并用超聲波加速整個提取進(jìn)程。

3.2 色譜和質(zhì)譜的指紋圖譜條件優(yōu)化分析 梯度洗脫的不但調(diào)整流動相的濃度配比條件優(yōu)化，能夠最大限度的縮短分析周期，并改善峰型減少其拖尾現(xiàn)象，提高藥物成分的分離程度及增加其靈敏度[14-16]。本實驗嘗試了水-乙腈、不同濃度甲酸水如0.05%甲酸水、0.10%甲酸水、0.20%甲酸水、0.50%甲酸水、1.00%甲酸水與乙腈的流動相濃度配比，水-甲醇、0.10%甲酸水分別與0.10%甲酸乙腈、甲醇、0.10%甲酸甲醇等流動相配比，結(jié)果以0.05%甲酸水-乙腈這一流動相系統(tǒng)為最優(yōu)的色譜和質(zhì)譜的指紋圖譜分析條件，得到較好且穩(wěn)定的色譜峰峰形;而在梯度洗脫程序中必須有穩(wěn)定的流速來保證其進(jìn)程的有序進(jìn)行，研究中采用恒流泵來保證流速的穩(wěn)定性，本研究最終選擇0.40 mL/min獲得色譜峰較好峰形且具有較好分離度。

3.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)定性分析 本研究中采用UPLC較普通的高效液相色譜法(HPLC)，具有更高的分離度，更高的速度以及更強(qiáng)的靈敏度[17]，同時本研究結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，利用質(zhì)譜對化合物鑒定的專門技術(shù)建立黃連、吳茱萸配伍藥對指紋圖譜，豐富黃連、吳茱萸配伍藥對指紋圖譜色譜峰的信息量、出峰數(shù)目、分離度，更加全面的反映了黃連、吳茱萸配伍藥對有效化學(xué)成分[18-20]。黃連-吳茱萸藥對配伍歷代醫(yī)家向來對其十分重視，歷代醫(yī)家及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)均不斷的在研究黃連-吳茱萸藥對是通過相須、相使的作用以增強(qiáng)療效；亦或是通過相畏相殺而起到相互制約而降低藥物的不良反應(yīng)。本質(zhì)譜研究中質(zhì)荷比選擇了100～1000和200～800 2個條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示100～1000范圍內(nèi)的質(zhì)荷比能獲得相對較多色譜峰數(shù)，以S1黃連、吳茱萸配伍藥對為樣品采用UPLC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測，鑒定16個特征色譜峰中主要成分和化合物，通過分析UPLC-MS與MS系統(tǒng)分析，同時結(jié)合色譜峰參考文獻(xiàn)[21-25]，結(jié)果顯示除了9、15和16號特征色譜峰外，來源于黃連的成分和化合物有分別歸屬其來源，其中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、黃連堿和表小檗堿;來源于吳茱萸的成分和化合物有吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿；結(jié)合化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，推測出3種化合物，分別為木蘭花堿、格陵蘭黃連堿和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮。