紫草素對銀屑病T淋巴細胞增殖、活化的影響

劉 欣 趙京霞 王 燕 李 萍

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院/北京市中醫(yī)研究所，北京，100010)

銀屑病中醫(yī)稱之為“白疕”，是一種臨床常見的難治性疾病，該病屬于具有一定遺傳背景的自身免疫性疾病，異?；罨腡淋巴細胞及其釋放的細胞因子是銀屑病發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。中醫(yī)認為，“血分蘊毒、熱毒入血傷絡(luò)”是銀屑病發(fā)病的主要病機[1]，治療上多以涼血解毒為法，涼血活血膠囊就是在該思想指導下由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)制的治療銀屑病血熱證的院內(nèi)制劑。前期工作證明，涼血活血膠囊不僅能夠顯著改善患者的紅斑、浸潤及瘙癢等癥狀、降低外周血炎性反應(yīng)遞質(zhì)水平，其全方及拆方組分還可顯著抑制體外T淋巴細胞的過度增殖、活化，體現(xiàn)出明顯的免疫抑制及抗炎作用。紫草為涼血活血膠囊中的君藥，具有涼血活血解毒的多重作用。為進一步研究涼血解毒類藥物對銀屑病的治療作用機制，本研究選擇紫草的主要活性成分紫草素作為研究對象，試圖觀察其對活化T淋巴細胞增殖、活化、釋放細胞因子的影響，并利用中藥單體對相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路做初步研究。

1 材料

1.1 細胞 Jurkat E6-1 T淋巴細胞株:中國醫(yī)學科學院協(xié)和細胞資源中心，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)條件下用含10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的PRIM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d進行傳代。

1.2 試劑 紫草素(shikonin)標準品(中國藥品生物制品鑒定所)；佛波醇酯(phorbol 12，13-dibutyrate，PDB)(美國Sigma公司，貨號P8139)；離子霉素(Ionomycin，IM)(美國Sigma公司，貨號I9657)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學研究所，貨號JG659)；CD69抗體(美國BD公司，貨號341652)；白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Instant ELISA檢測試劑盒(美國Bender公司，貨號分別為：BMS221HS，BMS228HS，BMS223HS)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司，貨號：23227)；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗小鼠IgG(H+L)遠紅外標記二抗(美國KPL公司，貨號分別為：072-07-15-06，072-07-18-06)；p-c-Jun(Ser 63)、p-核因子-κB p65單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為：9261P，3033)。

1.3 PCR引物 引物均由上海生工合成。見表1。

1.4 儀器 超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(MCO-20AIC型SANYO日本)，流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI7500應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)，細胞破碎儀(HD3100型，德國Bandlin公司)，酶標儀(美國Multiskanspeetrum Thermo公司)，Odyssey雙色紅外掃描儀(美國Gene Company Limited)。

2 方法

2.1 藥品制備 紫草素先用二甲基亞砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)溶解，然后用乙醇進行稀釋，臨用前以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)將溶液中DMSO含量稀釋至1‰以下，乙醇含量稀釋至10%以下，如在稀釋過程中出現(xiàn)紫草素析出，采用超聲使其完全溶解。

2.2 紫草素濃度篩選 CCK-8法檢測。將細胞濃度調(diào)至1×105/mL接種于96孔板中，每孔100 μL；以終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細胞，同時加入終濃度分別為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL的紫草素置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48 h；檢測前4 h，每孔加入10 μLCCK-8，酶標儀450 nm波長處檢測吸光度值。選擇對正常細胞無毒性且具有一定藥效學作用的濃度范圍作為后續(xù)實驗的應(yīng)用劑量。

2.3 紫草素對活化的T淋巴細胞活性的影響 CCK-8法檢測。將細胞濃度調(diào)至1×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細胞，同時加入由2.2確定劑量的紫草素。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，檢測前4 h，每孔加入10 μLCCK-8，酶標儀450 nm波長處檢測吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.4 紫草素對活化的T淋巴細胞表達CD69的影響 流式細胞術(shù)檢測。將細胞濃度調(diào)至2×105/mL接種于12孔板中，每孔1.5 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，同時加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。收集細胞并每組加入10 μL anti-CD69-PE，4 ℃冰箱避光孵育30～40 min。流式細胞儀檢測CD69陽性細胞表達率。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.5 紫草素對活化的T淋巴細胞分泌白細胞介素-2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。將細胞濃度調(diào)至1×106/mL加入12孔板中，每孔1 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，同時加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至48 h；離心收集細胞上清液，嚴格按ELISA試劑盒說明書步驟操作。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

2.6 紫草素對活化的T淋巴細胞內(nèi)游離[Ca2+]i的影響 流式細胞術(shù)檢測。將細胞濃度調(diào)至5×105個/mL接種于6孔板中，每孔1.5 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L PDB和5×10-7mol/L的IM，同時加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)16 h；收集細胞并加入濃度為5 μmol/L的Fluo-3AM 100 μL，37 ℃避光孵育30 min；洗去未結(jié)合染料，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強度。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.7 紫草素對活化的T淋巴細胞內(nèi)蛋白激酶C(PKC)磷酸化蛋白水平的影響 ELISA檢測。將細胞濃度調(diào)至1×106/mL接種于6孔板中，每孔3 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM刺激活化細胞，同時加入由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，裂解細胞提取蛋白。ELISA操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.8 紫草素對核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT和AP-1組分c-Jun mRNA表達的影響 q-PCR法檢測。將細胞濃度調(diào)至1×106個/mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔3 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM及確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。收獲細胞，提取細胞總mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。采用SYBR Green標記，ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測40個循環(huán)，采用2-△△CT法進行目的基因的相對定量分析。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.9 紫草素對核轉(zhuǎn)錄因子AP-1組分c-Jun及核因子-κB蛋白表達的影響 Western blotting法檢測。將細胞濃度調(diào)至1×106/mL接種于細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶7 mL；加入終濃度分別為2×10-7mol/L的PDB和5×10-7mol/L的IM，及由2.2確定劑量的紫草素，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。離心收集細胞，裂解、提取總蛋白，BCA法蛋白定量。將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，分別與p-c-Jun(1∶500)/p-核因子-κB-p65(1∶2000)/β-actin(1∶2000)一抗4 ℃孵育過夜。再與羊抗兔或羊抗鼠遠紅外標記的二抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1.5 h。Odyssey雙色紅外掃描儀進行條帶掃描。實驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 紫草素對活化的T淋巴細胞活性的影響 實驗結(jié)果顯示，4 μg/mL的紫草素將T淋巴細胞的活性降低至正常水平以下，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表現(xiàn)出對細胞具有殺傷毒性；2～0.5 μg/mL的紫草素均可顯著抑制經(jīng)PDB+IM刺激活化的T淋巴細胞的活性，降低細胞增殖率，抑制率分別達到31.51%、26.45%和26.45%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而濃度為0.25 μg/mL的紫草素對活化的T淋巴細胞未表現(xiàn)出抑制作用，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯示不出藥效。見表2。

因此，后續(xù)實驗選擇2～0.5 μg/mL作為紫草素的應(yīng)用濃度。

表2 紫草素對活化T淋巴細胞活性的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

表3 紫草素對T細胞活化標志CD69表達的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.2 紫草素對T細胞活化CD69表達的影響 本實驗用0.5～2 μg/mL的紫草素作用于經(jīng)PDB和IM活化的T淋巴細胞，結(jié)果顯示各濃度紫草素均可顯著降低T淋巴細胞表面CD69的表達率，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其抑制率分別為38.44%、61.18%和65.7%，平均降幅達55%。其中，以2 μg/mL的抑制作用最為明顯，其次為1 μg/mL，0.5 μg/mL的紫草素抑制率最低，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。見圖1、表3。

圖1 紫草素對T細胞活化標志CD69表達的影響

圖2 紫草素對活化的淋巴細胞中[Ca2+]i的影響

3.3 紫草素對活化T細胞分泌INF-γ的影響 以0.5～2 μg/mL的紫草素作用于活化的T淋巴細胞，均可顯著降低其INF-γ的分泌，分別為41.88%、61.51%、68.63%，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；其中以2 μg/mL紫草素的下調(diào)作用最為顯著，但其水平仍高于未活化細胞，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3.4 紫草素對活化T細胞分泌IL-2的影響 本實驗中，0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素均可顯著降低活化T淋巴細胞分泌IL-2的能力，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；以2 μg/mL的下調(diào)作用最為明顯，其抑制率可達74.74%，有效地抑制了細胞因子的過度釋放；0.5 μg/mL和1 μg/mL的紫草素對IL-2的抑制率分別為40.82%和50.83%，均不及2 μg/mL的作用，可見藥物濃度越高抑制作用越強。見表4。

3.5 紫草素對活化T細胞分泌TNF-α的影響 本實驗所用0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素均可顯著抑制活化的T淋巴細胞分泌TNF-α，其抑制率分別為19.63%、23.55%、49.34%,與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，藥物濃度越高則抑制率越高。其中2 μg/mL紫草素的抑制作用最為明顯，該組TNF-α的水平與對照組水平相當,與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明該濃度藥物具有很好地抑制TNF-α分泌的功效，可將細胞調(diào)節(jié)至活化前水平；0.5 μg/mL和1 μg/mL的紫草素雖也可有效降低T淋巴細胞分泌TNF-α的水平，但與對照組比較其水平仍過高,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 紫草素對活化T細胞分泌TNF-α和IL-2、INF-γ的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.6 紫草素對活化T淋巴細胞內(nèi)游離[Ca2+]i變化的影響 結(jié)果顯示，活化后的T淋巴細胞內(nèi)Ca2+熒光強度明顯升高，Ca2+峰明顯右移，活化后胞內(nèi)游離Ca2+濃度較靜息狀態(tài)提高近300%，與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。0.5 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL紫草素組細胞的Ca2+濃度較模型組均有所降低，其抑制率分別為18.18%、31.11%和64.84%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，降幅與藥物濃度正相關(guān)。見圖2、表5。

3.7 紫草素對胞質(zhì)PKC磷酸化蛋白水平的影響 實驗結(jié)果表明，經(jīng)活化后T淋巴細胞內(nèi)的PKC磷酸化蛋白水平明顯上升，比對照組提高62.28%，與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1 μg/mL和2 μg/mL的紫草素作用于細胞后，均可明顯降低其PKC磷酸化蛋白的水平，降幅分別為16.82%和21.4%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而0.5 μg/mL紫草素組的磷酸化蛋白的水平僅比模型組降低9.65%，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、表5。

表5 草素對活化T淋巴細胞中[Ca2+]i及PKC磷酸化蛋白水平的影響

注：與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.8 紫草素對T淋巴細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT mRNA表達的影響 本實驗中模型組核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT的mRNA大量表達，比對照組表達量提高2倍多(P<0.05)。經(jīng)不同濃度紫草素作用后的細胞，mRNA表達量均顯著下降，其降幅分別為31.71%、32.40%和47.74%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中0.5 μg/mL和1 μg/mL劑量組的作用相近；2 μg/mL組的抑制作用最為明顯，表現(xiàn)出高濃度藥物作用明顯的趨勢。見表6。

3.9 紫草素對T淋巴細胞核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun mRNA表達的影響 實驗表明，模型組細胞c-Jun mRNA表達量明顯高于對照組，比對照組提高52.05%(P<0.05)。經(jīng)0.5～2 μg/mL紫草素處理后的細胞c-Jun mRNA表達均有所下降，降幅分別為12.28%、18.13%、25.73%，與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與藥物濃度相關(guān)。見表6。

表6 草素對活化T淋巴細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT和c-Jun mRNA表達的影響

注:與模型組比較,*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05

3.10 紫草素對T淋巴細胞核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，模型組蛋白表達水平明顯高于對照組，0.5～2 μg/mL紫草素組的蛋白與模型組比較均有不同程度的降低。見圖3。

圖3 紫草素對活化的T淋巴細胞c-Jun蛋白表達的影響

3.11 紫草素對T淋巴細胞核因子-κB蛋白表達的影響 結(jié)果顯示，模型組核因子-κB蛋白表達水平明顯高于對照組；經(jīng)0.5～2 μg/mL紫草素處理后的細胞，其核因子-κB蛋白表達量均受到抑制，以1 μg/mL紫草素的作用最明顯。見圖4。

圖4 紫草素對活化的T淋巴細胞NF-κB蛋白表達的影響

4 討論

涼血活血膠囊是首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，該方是在趙炳南、張志禮等皮外科名家治療銀屑病常用有效方劑涼血解毒湯的基礎(chǔ)上經(jīng)過改進工藝研制而成，充分體現(xiàn)中醫(yī)對于銀屑病血熱證治療以“清熱涼血、活血解毒”為法的辨證思想，是“涼血、解毒”治則指導下治療銀屑病的有效方劑。本課題組對涼血活血膠囊治療銀屑病的臨床療效做了長期且深入的驗證和研究，證明該藥治療尋常型銀屑病血熱證安全有效，且涼血活血不留瘀，解毒養(yǎng)陰不傷正[2]。臨床研究證實，涼血解毒湯可明顯改善患者皮損處紅斑、浸潤面積、瘙癢等癥狀，總有效率達69.23%[3]；并且可明顯下調(diào)銀屑病血熱證患者外周血中IL-17、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平[4-6]，表現(xiàn)出一定的免疫抑制和調(diào)控作用。前期基礎(chǔ)研究表明，高、中、低劑量的涼血活血膠囊均可顯著抑制T淋巴細胞的異?；罨?，從而調(diào)控炎性反應(yīng)進程，具有一定的免疫抑制功效[7]；其涼血、解毒拆方組分雖然在一定程度上也可抑制炎性反應(yīng)，但總體作用不如全方[8]。

本課題組在對涼血活血膠囊的拆方研究中發(fā)現(xiàn)，組方中的涼血類與解毒類藥物在劃分時存在一個交叉點，即單味中藥紫草。紫草是涼血活血膠囊中的君藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。味苦，性寒。有涼血、活血、解毒、透疹之功[9]?？梢?，一味紫草身集涼血、解毒雙重功效，是涼血解毒中醫(yī)治則的典型代表。臨床研究表明，以紫草為君藥的紫草湯治療尋常型銀屑病總有效率達85.71%[9-10]。外用紫草乳膏可有效改善銀屑病皮損處的干燥、脫屑、瘙癢等癥狀，總有效率達75.86%[9，11]。實驗研究表明，紫草素可降低咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損的表皮層厚度，并可降低血清中IL-17、IL-6、TNF-α、IL-22的水平[12]；可抑制角質(zhì)細胞的過度增殖、誘導凋亡[13-14]；并可抑制樹突細胞成熟、分化，從而抑制其促淋巴細胞增殖的能力，從而改善銀屑病樣小鼠的皮損程度[15-16]。

本研究繼續(xù)觀察紫草素對T淋巴細胞活化及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的影響。結(jié)果顯示0.5～2.0 μg/mL不同劑量的紫草素均可明顯降低T淋巴細胞的增殖、顯著抑制細胞表面活化分子CD69的表達和T細胞分泌Th1類細胞因子的功能，且有劑量依賴性，表現(xiàn)出一定的免疫抑制作用。

T淋巴細胞的活化是受到嚴格調(diào)控的。其中，PKC的激活和細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高是活化的早期事件，也是調(diào)控T細胞活化的中心步驟。PKC活化后一方面可通過經(jīng)典的DAG、Ras、Raf和MAPKKK途徑激活Fos和Jun蛋白結(jié)合形成的異源二聚體AP-1，另一方面通過BCL-10、Carma1、MALT1等信號分子直接激活核因子-κB[17]。胞內(nèi)持續(xù)的Ca2+脈沖信號可誘導CaN磷酸化，導致核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT脫磷酸而被活化，并移位入核[18]?；罨暮宿D(zhuǎn)錄因子NF-AT與由PKC途徑生成的AP-1結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，與靶基因的調(diào)控元件結(jié)合，共同對靶基因的表達進行調(diào)控。而活化的核因子-κB與其抑制蛋白IκBα解離后轉(zhuǎn)位入核，其序列上有IL-2、INF-γ、TNF-α等多種基因的結(jié)合位點，可直接調(diào)控多種細胞因子的表達。

紫草素對T細胞活化信號轉(zhuǎn)導通路的研究結(jié)果顯示，0.5～2.0 μg/mL紫草素均可顯著降低細胞內(nèi)游離Ca2+的濃度和PKC磷酸化蛋白的水平，說明紫草素可對信號轉(zhuǎn)導通路上游的第二信使及關(guān)鍵節(jié)點激酶發(fā)揮抑制作用。由此提示，紫草素可能對信號轉(zhuǎn)導通路的下游同樣具有調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)控炎性反應(yīng)的進程。實驗對信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-1、核因子-κB mRNA和蛋白表達的研究結(jié)果證實：1)不同劑量的紫草素均對核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT mRNA的表達產(chǎn)生明顯的抑制作用，濃度越高抑制作用越明顯。2)各劑量紫草素均可有效降低AP-1主要組分c-Jun的mRNA表達，并對其蛋白表達也均有明顯的抑制趨勢。對c-Jun蛋白表達的抑制可有效抑制AP-1異源二聚體的形成，從而抑制AP-1的生物活性，使其無法與核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT在細胞核內(nèi)結(jié)合，進而遏制需二者共同啟動的靶基因的表達。3)各組紫草素均可抑制核因子-κB蛋白的表達，其中以1 μg/mL紫草素的作用最明顯。

綜上所述，本研究證明紫草素可以顯著抑制T淋巴細胞增殖、活化及細胞因子的釋放，具有一定的免疫抑制作用；同時還證明，紫草素可以通過下調(diào)信號轉(zhuǎn)導通路中的第二信使Ca2+濃度和關(guān)鍵節(jié)點激酶PKC的水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT、AP-1和核因子-κB等核轉(zhuǎn)錄因子的mRNA及蛋白表達，從而對T淋巴細胞活化的信號轉(zhuǎn)導通路進行調(diào)控。本研究為紫草素作為免疫抑制劑用于銀屑病的治療提供了實驗依據(jù)。