活血化瘀法與氨基葡萄糖膠囊治療創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響

陳明光 陳仕強 楊 寧 楊 進 李引剛 曹曉霞 常春峰 吳雪蘭

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨創(chuàng)傷一科,咸陽,712000; 2 陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽,712000; 3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院第二手術(shù)麻醉科,咸陽,712000)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種能夠影響關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜、半月板和韌帶的復(fù)雜的退行性疾病[1]。OA是一種進行性疾病,當(dāng)病情的發(fā)展最終導(dǎo)致顯著性殘疾時,通常需要昂貴的關(guān)節(jié)成形術(shù),目前OA的臨床治療受到限制,暫無治愈OA的藥物。創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(Post-traumatic Osteoarthritis,PTOA),是OA潛在亞型中的一種,占OA總數(shù)的12%以上,最常見于踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)損傷,特別是關(guān)節(jié)內(nèi)骨折,引發(fā)的一種進行性關(guān)節(jié)退變疾病[2-4]。其中由膝關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性病變的繼發(fā)性O(shè)A稱為創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎(Post-traumatic Knee Osteoarthritis),是老年致殘的五大主要成因之一[5]。文獻報道,在OA關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)的合成代謝、基質(zhì)組分修復(fù)和分解代謝紊亂之間存在不平衡,因此通常認為疾病的發(fā)生歸因于關(guān)節(jié)組織的損壞[6]。軟骨細胞通過停止產(chǎn)生合成代謝因子和釋放更多的分解代謝酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)來應(yīng)答關(guān)節(jié)組織的損壞[7]。有證據(jù)表明,軟骨細胞表達的基質(zhì)降解酶和它們的抑制劑MMP3的比例異常增加可破壞細胞外基質(zhì),引發(fā)關(guān)節(jié)損傷[8]。創(chuàng)傷后膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床表現(xiàn),診斷方法和治療方面的考慮與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患者的類似,兩者主要區(qū)別是在初始診斷時二者的年齡差異,創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎患者初始診斷年齡一般較原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患者早。并且兩者目前均無可治愈性藥物,具體發(fā)病機制也尚不清楚。目前主要采用口服鹽酸氨基葡萄糖、活血化瘀類中藥方來緩解此類疾病的臨床癥狀,而創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制的探討較少。本文將分別采用口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊和口服活血化瘀中藥湯劑來治療創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎,并探討其相關(guān)發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年12月陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院收治的創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎患者60例,其中男33例,女27例,平均年齡(48.5±11.7)歲;將擬納入的60例病例按就診順序編號從1～60號,在電子計算機上應(yīng)用Excel產(chǎn)生隨機數(shù),并按1∶1比例隨機分為觀察組和對照組,每組30例。隨機化研究有其特殊的醫(yī)患問題,必須認真仔細對待。該研究特別強調(diào)隨機分配的是患者而不是膝關(guān)節(jié)。如果一個患者被診斷為兩側(cè)膝關(guān)節(jié)炎,則被分配到一組。觀察組和對照組在治療前、治療6個療程后進行關(guān)節(jié)液與血液抽取。關(guān)節(jié)液的抽取:從髕骨上方、股四頭肌腱外側(cè)將注射器向內(nèi)下刺人關(guān)節(jié)囊。進入關(guān)節(jié)腔后,抽出關(guān)節(jié)液1～3 mL,立即置無菌離心管中,在4 ℃條件下2 000 r/min離心10 min,取上清液置于-80 ℃冰箱(山東博科科學(xué)儀器有限公司,BDF-86H50)保存?zhèn)溆?。血清的制?患者在安靜狀態(tài)下空腹采血5 mL,4 ℃條件下離心后抽取上層血清取上清液置于-80 ℃冰箱(山東博科科學(xué)儀器有限公司,BDF-86H50)保存?zhèn)溆谩５鞍仔酒嚓P(guān)檢測產(chǎn)品與分析服務(wù)由上海英拜生物科技有限公司提供。產(chǎn)品人金屬基質(zhì)酶定量抗體芯片Human MMP Array:MMP-1,MMP-3，MMP-13均購于上海英拜生物科技有限公司。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考美國風(fēng)濕協(xié)會1995年診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均有膝關(guān)節(jié)外傷史或者慢性勞損病史,且臨床表現(xiàn)出膝關(guān)節(jié)疼痛及功能活動障礙,均符合中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會提出的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除標(biāo)準(zhǔn)參考蘇雅紅等病理排除標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.5 治療方法 對照組患者在飯時或飯后口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊(由浙江誠意藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20060748),1粒/次,2次/d。觀察組給予口服活血化瘀止痛中藥復(fù)方湯劑處理,中藥湯劑選用自擬方:當(dāng)歸15 g、川芎12 g、白芍12 g、桂枝9 g、牛膝12 g、雞血藤15 g、土鱉蟲10 g、血竭5 g、麻黃6 g、生甘草15 g),制劑由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供。服藥方法參考蘇雅紅等湯劑煎服劑量[9],1劑/d,水煎服,2次/d。觀察組與對照組連續(xù)用藥4周為1個療程,觀察時間為6個療程,觀察期間不得使用其他具有止痛作用的中藥和西藥,不進行任何理療、針灸及外用藥物治療。

1.6 觀察指標(biāo) 觀察膝關(guān)節(jié)癥狀分級量化評分,膝關(guān)節(jié)疼痛指數(shù),中醫(yī)癥候積分,首次用藥疼痛起效時間,舌、脈象變化等。

1.7 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

1.7.1 療效評價指標(biāo)及臨床評價時點 1)膝關(guān)節(jié)癥狀分級量化評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)參考邱建文等[10],治療前、治療1周、12周、24周各記錄1次;2)膝關(guān)節(jié)疼痛指數(shù),通過患者記錄卡每周記錄;3)中醫(yī)癥候積分,治療前、治療12周、治療后各記錄1次;4)首次用藥疼痛起效時間,由患者記錄首次服藥后,自覺疼痛開始緩解的時間(以天為單位計);5)舌、脈象變化:治療前、治療12周、治療后各記錄1次。

1.7.2 膝骨性關(guān)節(jié)炎恢復(fù)情況判定標(biāo)準(zhǔn) 1)臨床控制:膝關(guān)節(jié)癥狀量化積分減少≥95%;2)顯效:膝關(guān)節(jié)癥狀量化積分減少≥70%,<95%;3)有效:膝關(guān)節(jié)癥狀量化積分減少≥30%,<70%;4)無效:膝關(guān)節(jié)癥狀量化積分<30%。

1.7.3 中醫(yī)癥候恢復(fù)情況評價 1)臨床控制:中醫(yī)癥候積分減少≥95%;2)顯效:中醫(yī)癥候積分減少≥70%,<95%;3)有效:中醫(yī)癥候積分減少≥30%,<70%;4)無效:中醫(yī)癥候積分<30%。

2 結(jié)果

2.1 治療后2組創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎恢復(fù)情況 結(jié)果顯示觀察組和對照組在治療6個療程后,觀察組的控顯率和總有效率明顯高于對照組,其中觀察組和對照組的控顯率分別為63.3%和36.7%,總有效率分別為93.3%和73.3%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。即2種治療方法均能對創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎起到一定程度的恢復(fù)效果,而口服活血化瘀中藥湯劑對創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎恢復(fù)情況比口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊效果要顯著。見表1。

2.2 2組治療前后膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)狀分級量化積分和膝關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)的記錄 2組在治療1周、12周和24周后的積分和疼痛指數(shù)均較治療前均顯著降低(對照組:P<0.05,P<0.01,P<0.01;觀察組:P<0.01,P<0.01,P<0.01),且觀察組在6個療程的治療過程中積分和疼痛指數(shù)均顯著低于對照組,2組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、表3。

表1 2組治療前后創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎的恢復(fù)情況比較

注:與對照組比較,*P<0.05

表2 2組治療前后膝關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)狀分級量化積分比較分)

注:與治療前比較,*P<0.05,**P<0.01;與對照組比較，△P<0.05

表3 2組治療前后膝關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)比較

注:與治療前比較,*P<0.05,**P<0.01;與對照組比較，△P<0.05

表4 2組治療前后中醫(yī)癥候情況比較

注:與對照組比較,*P<0.05

2.3 2組治療前后中醫(yī)癥候的恢復(fù)情況比較 觀察組和對照組在治療后,觀察組控顯率和總有效率均明顯高于對照組,其中觀察組的控顯率和總有效率分別為66.7%和9%,而對照組的分別為40.0%和76.7%,對照組和觀察組兩者之間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.4 2組治療前后中醫(yī)癥候積分的比較 比較2組治療前,在治療后第12周和治療后的中醫(yī)癥候積分均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),并且治療后2組之間進行比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示,2種治療方法均能明顯降低中醫(yī)癥候積分,且觀察組的治療效果明顯優(yōu)于對照組。見表5。

2.5 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP13水平的檢測結(jié)果比較 蛋白芯片檢測儀檢測出的熒光強度的強弱代表蛋白的表達水平的高低。結(jié)果顯示在關(guān)節(jié)液中,對照組治療前后MMP13的熒光強度分別為(5 162.6±279.4)和(5 241.4±223.0);而在血清中治療前后的熒光強度分別為(3 414.6±189.4)和(3 451.3±263.3);觀察組治療前后關(guān)節(jié)液中MMP13的熒光強度分別為(4 988.8±218.7)和(5 125.8±348.4);而血清中治療前后的熒光強度分別為(3518.8±248.5)和(3 625.7±368.2);對照組和觀察組在治療前后關(guān)節(jié)液和血清中的MMP13的熒光強度均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

2.3 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP3水平的檢測結(jié)果比較 對照組和觀察組治療前關(guān)節(jié)液中MMP3的熒光強度分別為(4 623.6±215.2)和(4 678.3±198.5),而治療后均明顯呈現(xiàn)出熒光強度的降低,分別為(2 288.6±293.7)和(2 321.3±198.4),2種療法治療前后熒光強度統(tǒng)計分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.001);而在血清中對照組和觀察組治療前后MMP3的熒光強度也均呈現(xiàn)明顯下降,對照組和觀察組治療前MMP3的熒光強度分別為(3 393.6±202.6)和(2 394.3±243.8),治療后熒光強度分別為(3 425.3±193.1)和(2 421.3±294.7),治療前后的熒光強度值進行比較分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表7。

2.4 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP1水平的檢測結(jié)果比較 結(jié)果顯示對照組在治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP1的熒光強度均無明顯改變,對照組治療前關(guān)節(jié)液和血清中MMP1的熒光強度分別為(3 913.7±295.8)和(2 917.9±250.0),治療后MMP1的熒光強度分別為(3 788.6±372.1)和(2 882.1±282.3),P>0.05;觀察組在治療前關(guān)節(jié)液和血清中MMP1的熒光強度分別為(3 898.1±342.6)和(3 037.8±289.2),治療后關(guān)節(jié)液和血清中MMP1熒光強度均明顯降低,分別為(3 521.3±436.2),(P<0.001)和(2 721.4±378.4),(P<0.001)。見表8。

表5 2組治療前后中醫(yī)癥候積分比較分)

注:與治療前比較,**P<0.01;與對照組比較,△P<0.05

表6 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP13水平檢測結(jié)果

表7 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP3水平檢測結(jié)果

注:與治療前比較,***P<0.001

表8 2組治療前后關(guān)節(jié)液和血清中MMP1水平檢測結(jié)果

注:與治療前比較,***P<0.001

3 討論

目前創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎的病因尚不明確,臨床研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)炎患者在膝關(guān)節(jié)處曾發(fā)生過單一的創(chuàng)傷性損傷,創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷引起炎性細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶蛋白酶和其他降解酶的激增,這些降解酶中尤其是MMP有助于軟骨和軟骨下骨的退化[11]。在關(guān)節(jié)軟骨和骨骼中存在的MMP能夠在中性pH的條件下降解蛋白聚糖,蛋白聚糖在軟骨受損的修復(fù)過程中扮演著重要角色,一旦合成失衡,就會加劇軟骨退化。之前研究發(fā)現(xiàn)從人類關(guān)節(jié)軟骨中分離得到的MMP3能夠裂解聚蛋白聚糖IGD結(jié)構(gòu)域中Asn341和Phe342之間的化學(xué)鍵,其他MMP家族成員如MMP1和MMP13之后也被發(fā)現(xiàn)能夠裂解相同位點以及該分子的C末端的其他位點[11]。MMP3是OA軟骨中的表達量最高的基質(zhì)金屬蛋白酶,以參與激活MMP1和MMP13的酶活性而為人所熟知,并且可能通過激活隱藏的膠原酶活性導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[12]。

有文獻報道在膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)期間獲得的人骨關(guān)節(jié)炎外植體中,給予5 mL的鹽酸氨基葡萄糖處理,可以顯著性降低外植體中總的基質(zhì)金屬蛋白酶活性,同時能夠顯著性降低MMP3的基因表達水平,但是對MMP1、MMP13的基因表達水平無明顯影響[13],此結(jié)果也與本研究結(jié)果中對照組鹽酸氨基葡萄糖的治療效果基本一致。本研究同樣發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎患者在經(jīng)鹽酸氨基葡萄糖治療后,關(guān)節(jié)液和血清中只有MMP3的熒光強度明顯降低,MMP1和MMP13均無明顯變化。王平等[14]研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀膏能夠有效的緩解早中期膝骨性關(guān)節(jié)患者的臨床表征,但是對關(guān)節(jié)液中MMP13的表達無明顯效果,本研究也發(fā)現(xiàn)了口服活血化瘀協(xié)定方湯劑治療后能夠明顯降低患者的膝骨關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)狀分級量化積分、膝關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)、中醫(yī)癥候積分,并且顯著性的修復(fù)創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎,其總有效率比較于鹽酸氨基葡萄糖組明顯增加,高達93.3%;在創(chuàng)傷性膝骨性關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)證候的恢復(fù)情況統(tǒng)計中也發(fā)現(xiàn)觀察組的總有效率比較于對照組顯著增加,高達96.7%。并且發(fā)現(xiàn)活血化瘀法治療后患者關(guān)節(jié)液和血清中MMP13的熒光強度也基本保持不變,表明活血化瘀法治療對MMP13的表達無明顯作用。但是在本次研究中發(fā)現(xiàn)活血化瘀法治療后能顯著性下調(diào)患者血清和關(guān)節(jié)液中MMP1和MMP3的熒光強度,這也許能說明為何活血化瘀法臨床治療的總有效率明顯高于鹽酸氨基葡萄糖組。與本文研究類似的是,在兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨模型中發(fā)現(xiàn),兔關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨中MMP1、MMP3的表達量顯著升高,而活血化瘀膏加失笑散治療后能顯著降低滑膜和軟骨中MMP1和MMP3的表達水平[15]。由此,可說明活血化瘀法中的中藥成分可能是通過抑制MMP1和MMP3的表達,緩解創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎中MMPs對軟骨的損傷作用的。有文獻報道活血化瘀法能夠有效的抑制炎性細胞因子比如IL-1β和TNF-α的表達,而這2種因子同樣可以調(diào)控多數(shù)MMPs的基因的轉(zhuǎn)錄水平,或許能夠解釋本研究中活血化瘀法對MMP1和MMP3的抑制作用,即它可能是通過抑制炎性細胞因子的表達,轉(zhuǎn)而在基因水平下調(diào)這2種酶的表達,導(dǎo)致這2種酶蛋白含量降低。

本研究分別使用了2種方法來治療創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服鹽酸氨基葡萄糖膠囊和口服活血化瘀協(xié)定方湯劑均能有效的緩解患者的臨床癥狀,并且這種治療效果可能是歸因于藥物對關(guān)節(jié)液和血清中MMP的抑制效果?；钛鲋兴幏傆行矢哂邴}酸氨基葡萄糖膠囊,可能是由于活血化瘀中藥湯劑中復(fù)雜的中草藥成分能夠有效的抑制MMP1和MMP3的蛋白表達量,而鹽酸氨基葡萄糖膠囊只能單一的抑制MMP3的蛋白表達量,從而有效的降低對軟骨的破壞作用,緩解疾病的進程。