MG132對草酸鈣腎結石模型TGF-β1及EMT的影響

王 銳，劉亞東，于時良，任 昌，安瑞華

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

腎結石是泌尿外科常見疾病之一。結石形成后在局部反復刺激上皮細胞促進腎間質纖維化[1-2]。腎結石絕大多數(shù)為草酸鈣(calcium oxalate，Ca Ox)結石，因此構建草酸鈣腎結石模型對研究抗腎纖維化機制就更具有普遍意義[3]。高草酸尿是草酸鈣腎結石的主要危險因素之一，可對腎小管上皮細胞產(chǎn)生損傷，促進結石的滯留和粘附[4-6]。

草酸結晶可通過激活轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)/Smads途徑誘導腎小管上皮細胞發(fā)生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進而促進腎纖維化的發(fā)生[5]。MG132是一種醛基肽類泛素-蛋白酶體抑制劑，可抑制蛋白的泛素化活性，并能以劑量依賴方式抑制TGF -β1 誘導的腎間質成纖維細胞的增殖[5]。本文從細胞實驗層面多個角度闡述MG132可抑制EMT的形成及減少細胞氧化應激損傷，進而抑制腎間質纖維化的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1材料高糖改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)合成液體培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MG132蛋白酶體抑制劑(美國Sigma公司)，兔抗人上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)單克隆抗體、兔抗人Smad7單克隆抗體、兔抗人TGFβ1單克隆抗體(美國Abcam公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(上海碧云天公司)，活性氧檢測試劑盒2′-,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′-,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH -DA)(中國碧云天生物技術有限公司)。

1.2細胞培養(yǎng)犬遠端腎小管上皮細胞馬丁達比狗腎(madin-darby canine kidney，MDCK)由本實驗室保存。將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的溫度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細胞生長至覆蓋率為80%左右時予以藥物草酸和MG132干預。研究共分為3組：正常對照組、草酸干預組(Oxalate組)、草酸+MG132干預組(Ox+MG132組)。

1.3Westernblot細胞模型構建完成后提取蛋白，采用蛋白定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)配制后依次電泳、電轉，用含5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h、孵育E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7抗體1 h，4 ℃冰箱過夜。次日以含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with tween-20，PBST)洗滌后用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗孵育1 h，再次用PBST洗滌后將聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜放入Bio-Rad成像儀，選擇合適的參數(shù)，滴加電化學發(fā)光(electro-chemi-luminescence，ECL)發(fā)光液后進行顯影，對結果運用Image Lab軟件分析處理。

1.4活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)檢測細胞種植于6孔板中，待細胞生長覆蓋率達到80%左右時，予以草酸和MG132干預2 h。誘導完畢后，胰酶消化細胞離壁至離心管中。離心后加入含DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)液將離心管中細胞重懸，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，期間每間隔3～5 min吹打混合一次。然后各組取相同數(shù)目的細胞重懸于500 uL的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中。再用200目濾網(wǎng)過濾轉移至流式碧迪醫(yī)療(becton dickinson，BD)管中，適度搖勻后上機檢測。結果用流式分析軟件分析計算，所有實驗操作均3次以上。

1.5細胞內超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)水平的測定SOD對機體的氧化與抗氧化平衡有重要作用，其可以清除超氧陰離子自由基從而保護細胞免受損傷。由黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，在550 nm處用酶標儀測其吸光度。計算公式為0.5×(對照吸光度A值-測定A值)/(對照A值)×反應體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2 結 果

2.1ROS發(fā)生率流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)(圖1、圖2)，草酸組較正常組ROS發(fā)生率增加4倍左右。而與草酸組相比，MG132組會降低草酸誘導所產(chǎn)生的ROS。

圖1各組干預后ROS的發(fā)生率(%)

A:正常對照組；B：Oxalate組；C：Ox+MG132組。

圖2 各組干預后活性氧表達量柱形圖*與Oxalate組比較，P<0.01。

2.2EMT相關蛋白的表達各組蛋白表達具體結果見圖3A,與正常組相比， Vimentin、N-cadherin表達升高，而MG132干預后上述蛋白的表達量會降低；而E-cadherin表達與間質蛋白表達量完全相反(圖3B、C、E)。

2.3TGFβ1/Smads通路相關蛋白的表達TGFβ1蛋白在草酸干預后表達量增加，而MG132會減弱這種影響。而Smad7負反饋調節(jié)TGFβ1的表達，3組間該蛋白的表達量與TGFβ1相反(圖3D、F)。

圖3E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7蛋白的表達

A：E-cadherin、N-cadherin、TGFβ1、Vimentin、Smad7蛋白表達條帶圖；B：上皮鈣黏蛋白表達水平柱狀圖；C:N -鈣黏著蛋白表達水平柱狀圖；D:轉化生長因子β1表達水平柱狀圖；E：波形蛋白表達水平柱狀圖；F:Smad7蛋白表達水平柱狀圖。*：與Oxalate組相比(P<0.05)。

2.4SOD表達量草酸損傷腎小管上皮細胞，MG132組因可緩解草酸所帶來的損傷，故草酸組SOD的表達量均低于正常、MG132干預組(圖4)。

圖4 超氧化物歧化酶(SOD)表達量*與Oxalate組相比，P<0.05。

3 討 論

泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system，UPS)是細胞內溶酶體外蛋白降解的主要途徑之一，是一種細胞內高效和高度選擇性蛋白降解途徑，已被認為是真核細胞內僅次于磷酸化的重要信號調節(jié)機制[7]。此外在凋亡、轉錄調控、增殖、細胞表面受體表達、離子通道調控、Nrf2降解等許多細胞基本進程中UPS的功能是必要的[8]。MG132是一種肽醛類蛋白酶體抑制劑，目前已經(jīng)作為新的治療靶點和治療策略應用于蛋白酶體生物學[9]。其可以通過抑制蛋白酶體的活性來特異性阻斷UPS介導的蛋白降解，可以通過減少Nrf2的降解發(fā)揮抗氧化作用，低劑量的MG132可促使Nrf2表達量增加，高劑量的MG132則發(fā)揮相反作用促使細胞凋亡及發(fā)生氧化應激[10]。

EMT是腎間質纖維化形成最重要的病理過程，腎間質纖維化形成是導致腎功能喪失的最主要的病理生理過程之一[11]。EMT形成的標志是腎小管上皮細胞失去其上皮細胞表型E-cadherin和vimentin，以此來達到破壞的腎小管基底膜轉位至腎間質，分泌Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等細胞外基質增多，從而引起腎間質纖維化[11-12]。

Smad7是Smads中的抑制劑，通過抑制Smad2/3的磷酸化來抑制TGF-β信號通路。既往研究發(fā)現(xiàn)破壞Smad7的功能可以加速梗阻性腎病的炎癥和纖維化[13]。此外，由核因子-KB(nuclear factor-kappa B，NF-kB)激活所導致的腎臟纖維化和炎癥也可以經(jīng)過Smad7的表達而抑制[14]。蛋白酶體抑制劑MG132可減少Smad7的泛素化降解，進而可以抑制TGF-β/Smads信號通路的傳遞，通過以劑量依賴的方式抑制TGF-β1誘導的腎間質成纖維細胞增殖并促其凋亡[15]。

草酸對腎小管細胞的損傷及促結石作用主要是其在細胞內介導產(chǎn)生的ROS導致?，F(xiàn)已認為，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是草酸誘導腎小管細胞產(chǎn)生ROS的主要來源[16]。NADPH氧化酶受到TGF-β的調控[17]。HONG等[18]的研究證實了阻斷TGF-β1-NADPH-ROS途徑的任意一個階段均會抑制ROS的產(chǎn)生，因此，TGF-β1-NADPH-ROS通路是草酸誘導ROS生成的主要途徑。SOD是機體內存在的一種能清除ROS的抗氧化物酶。

我們的實驗結果表明，MG132可以減少草酸干預導致的TGF-β1的表達，并能顯著降低草酸引起的ROS及其相關損傷后SOD的表達。故而推測MG132能通過干預TGF-β1-NADPH-ROS通路來抑制草酸誘導的ROS的產(chǎn)生。同時我們實驗結果還顯示，MG132能降低EMT形成標志的蛋白： E-cadherin和 vimentin的產(chǎn)生，加之KANLAYA等[5]發(fā)現(xiàn)草酸鈣結晶通過TGF-β1 刺激上皮細胞-間質轉化，故我們推測MG132是通過抑制TGF-β1/smad通路來介導抑制EMT的產(chǎn)生。但以上兩種推測的具體機制還有待進一步研究。