IQGAP3基因表達(dá)對(duì)膀胱癌患者臨床病理和預(yù)后的影響

杜國(guó)偉，晏 鑫，郭梓鑫，蔣佳志，黃 凱，李 勝，2，劉同族，3

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院生物樣本庫(kù)，湖北武漢 430071；3.武漢市泌尿男生殖系腫瘤臨床研究中心，湖北武漢 430071)

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年有近74 000例新診斷的病例[1]。在中國(guó)，膀胱癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的癌癥，居所有癌癥中的第8位[2]。近3/4的高風(fēng)險(xiǎn)膀胱癌的患者將會(huì)復(fù)發(fā)、進(jìn)展或診斷后10年內(nèi)死亡[3]。盡管近年在診療方面取得了一定進(jìn)展，但死亡率并沒有明顯改變[4]。因此，探索與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)的基因，具有十分重要的臨床意義。含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQ motif containing GTPase activating protein 3，IQGAP3)是一種可調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長(zhǎng)的基因，被認(rèn)為是Rac1和Cdc42的效應(yīng)子,是海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)所必需的[5]。IQGAP3在HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用，RNA干擾IQGAP3的表達(dá)能導(dǎo)致胞質(zhì)分裂受阻，產(chǎn)生多核細(xì)胞[6]。近年來(lái)，IQGAP3在腫瘤中的報(bào)道呈不斷增多的趨勢(shì)。IQGAP3被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)增高，如在乳腺癌[7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]和肝癌[10]。但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)于IQGAP3與膀胱癌的關(guān)系報(bào)道較少。因此，本研究通過生物信息學(xué)分析探討IQGAP3基因與膀胱癌的關(guān)系，分析膀胱癌的臨床特征和預(yù)后，為膀胱癌的研究和防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載基因表達(dá)譜膀胱癌樣本數(shù)據(jù)集GSE13507[11-12]。該數(shù)據(jù)集包含了165例原發(fā)性膀胱癌患者的基因表達(dá)譜及性別、年齡、TNM分期等臨床信息和10例正常膀胱組織的基因表達(dá)譜。在GSE13507中，IQGAP3基因?qū)?yīng)的探針為ILMN_1813638。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)集篩選和臨床相關(guān)性研究 選擇GSE13507數(shù)據(jù)集中所有膀胱癌相關(guān)的樣本信息，排除臨床資料缺失的樣本。篩選完樣本后，對(duì)IQGAP3的表達(dá)量進(jìn)行由高到低排序，中位數(shù)(10.60)之前的樣本作為高表達(dá)組(n=82)，之后的樣本作為低表達(dá)組(n=83)。

1.2.2基因集富集分析 基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)[13]采用GSEA 3.0版本進(jìn)行分析。GSEA13507數(shù)據(jù)集中的腫瘤組織樣本，根據(jù)IQGAP3的表達(dá)水平高低被分為兩組，再通過GSEA分析IQGAP3的表達(dá)水平對(duì)各種生物通路基因集的影響。以Hallmark基因集為參照基因集，按照GSEA軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行GSEA分析，置換次數(shù)為1 000次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 21.0和Graphpad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IQGAP3基因在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達(dá)水平，采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)分析IQGAP3基因表達(dá)高低與膀胱癌患者臨床特征的相關(guān)性；采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行各組間生存分析的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在GSEA中，以P<0.05及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié) 果

2.1IQGAP3在正常膀胱組織與膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)情況本研究比較正常膀胱組織細(xì)胞(n=10)與膀胱癌細(xì)胞(n=165)樣本中IQGAP3的表達(dá)情況，IQGAP3在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)水平為10.38±0.10，在正常膀胱組織中表達(dá)水平為7.74±0.12，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.435，P<0.0001)。以上結(jié)果表明膀胱癌組織IQGAP3的基因表達(dá)水平顯著高于正常膀胱組織(圖1)。

圖1 IQGAP3在膀胱癌組織與正常膀胱組織中的表達(dá)水平

2.2IQGAP3基因表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性本研究選擇GSE13507數(shù)據(jù)集中165例膀胱癌患者的臨床病理特征與IQGAP3基因在膀胱癌患者表達(dá)水平的高低進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(表1)，IQGAP3基因在膀胱癌中的表達(dá)水平與患者的年齡(P=0.001)、性別(P=0.042)、腫瘤的進(jìn)展(P=0.002)、分級(jí)(P<0.001)、肌層浸潤(rùn)(P<0.001)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.013)方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與M分期(P=0.987)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3IQGAP3與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)性利用生存分析評(píng)價(jià)IQGAP3基因與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)性。本研究選取GSE13507數(shù)據(jù)集中腫瘤特異性生存結(jié)局、總生存結(jié)局及生存時(shí)間進(jìn)行生存分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(圖2)，IQGAP3高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的5年腫瘤特異性生存率分別為67.156%和93.318%(Log-rank=17.48，P<0.000 1，HR=0.185 9,95%CI：0.112 1～0.452 1，圖2A)，5年總生存率分別為49.100%和72.800%(Log-rank=13.04，P=0.000 3，HR=0.418 0，95%CI：0.256 4～0.666 2，圖2B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明IQGAP3高表達(dá)組會(huì)影響膀胱癌患者的生存期，可作為膀胱癌患者預(yù)后的評(píng)價(jià)因子。

表1 IQGAP3基因表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 (例)

*：IQGAP3高表達(dá)N分期有1例數(shù)據(jù)缺失。

圖2 IQGAP3表達(dá)水平與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)性A、B分別為與腫瘤特異性生存率、總生存率的關(guān)系。

2.4IQGAP3基因高表達(dá)的GSEA分析本研究選取GSEA13507數(shù)據(jù)集，運(yùn)用GSEA分析方法初步分析IQGAP3基因表達(dá)水平對(duì)各種生物信號(hào)通路的影響，探討可能與之相關(guān)的機(jī)制。GSEA結(jié)果提示IQGAP3高表達(dá)的樣本富集了與調(diào)節(jié)精子發(fā)生、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號(hào)通路、有絲分裂紡錘體、去折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)的基因集(表2)，表明IQGAP3可能通過調(diào)節(jié)這些生物學(xué)過程或通路等方式影響膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展。

表2 IQGAP3高表達(dá)的膀胱樣本基因集富集分析

3 討 論

含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白(IQGAP)家族由3個(gè)成員組成：IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3。2007年IQGAP3基因開始被發(fā)現(xiàn)[5]，是這個(gè)家族的最新成員，它參與了上皮細(xì)胞的增殖，然而，其在腫瘤發(fā)生中的作用仍有待確定[14-15]。IQGAP3位于1q22染色體，這是癌癥基因擴(kuò)增的熱點(diǎn)，并在肝臟和腸道等器官中受到限制性表達(dá)[5]。此前,相關(guān)研究表明IQGAP3基因可能參與多種癌癥的病理過程。例如，HU等[7]發(fā)現(xiàn)IQGAP3在乳腺癌中表達(dá)顯著增加，可作為乳腺癌進(jìn)展期細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；YANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)IQGAP3在肺癌中高表達(dá)，它能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及遷移和侵襲；QIAN等[10]研究表明，IQGAP3在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)顯著高于肝硬化患者和健康對(duì)照者，可能成為肝細(xì)胞肝癌篩查和診斷的新型互補(bǔ)生物標(biāo)志物。此外，KIM等[16]研究發(fā)現(xiàn)尿游離核酸IQGAP3明顯高于正常對(duì)照組，尿游離核酸IQGAP3可能是膀胱癌的補(bǔ)充診斷生物標(biāo)志物?？傊?，以上文獻(xiàn)證實(shí)IQGAP3與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。然而，對(duì)于IQGAP3在膀胱癌中的表達(dá)以及臨床意義，國(guó)內(nèi)外研究較少或不夠全面。

本研究通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)，IQGAP3在膀胱癌組織中的表達(dá)比在正常組織中顯著增高，表明其在膀胱癌細(xì)胞中為高表達(dá)，可能作為促癌基因。進(jìn)一步分析提示，IQGAP3的表達(dá)與膀胱癌患者的性別、年齡、腫瘤的進(jìn)展、分級(jí)、肌層浸潤(rùn)、T分期、N分期密切相關(guān)。高表達(dá)IQGAP3基因的膀胱癌患者腫瘤分期、疾病分級(jí)、病情進(jìn)展、生存期方面明顯差于低表達(dá)IQGAP3的膀胱癌患者，說明IQGAP3基因的高表達(dá)與膀胱癌的惡性程度、疾病進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)，這與前面提到的國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果相一致[7-8,10,16]。以上分析表明IQGAP3可能成為膀胱癌患者預(yù)后的評(píng)價(jià)分子之一。

探討IQGAP3基因可能調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路，相關(guān)研究證明IQGAP3特異性定位于有絲分裂后期的赤道皮層，通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在有絲分裂期間對(duì)收縮裝置的定位來(lái)影響細(xì)胞增殖分裂[17]。最新研究表明IQGAP3影響心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期，通過IQGAP3與有絲分裂紡錘體的定位模式分析，區(qū)分心肌細(xì)胞的增殖與雙核化[18]。本研究通過GSEA分析顯示，IQGAP3可能通過多種與細(xì)胞周期相關(guān)的生物學(xué)過程(如精子發(fā)生、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號(hào)通路、有絲分裂紡錘體、及未折疊蛋白反應(yīng))來(lái)調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖，這與前面述及IQGAP3通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖的結(jié)果一致[17-18]，提示IQGAP3在膀胱癌細(xì)胞中也可能存在類似的機(jī)制，即IQGAP3可能通過調(diào)節(jié)膀胱細(xì)胞周期影響膀胱癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，IQGAP3在膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可能成為潛在的判斷膀胱癌預(yù)后的標(biāo)志物及腫瘤防治的新靶點(diǎn)。未來(lái)需開展更深入的機(jī)制研究加以驗(yàn)證。