電針對(duì)腦卒中后抑郁大鼠腦細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF、BFGE表達(dá)的影響

余 濤 陸方琴 嚴(yán)嘉寧 趙立峰 韋登明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江 寧波 315211)

腦卒中后抑郁(PSD)指腦卒中導(dǎo)致的有明顯臨床癥狀的一種繼發(fā)性抑郁癥，是腦卒中發(fā)生后以情緒低落、興趣減退為主要表現(xiàn)的一種心理障礙。電針治療是一種安全無(wú)毒療效顯著的治療手段，前期研究已經(jīng)確定其對(duì)PSD有治療效果〔1〕。但其治療機(jī)制尚不完全清楚。有研究證實(shí)，普通慢性抑郁癥患者或動(dòng)物均出現(xiàn)海馬體積減少的現(xiàn)象，海馬體積的減少與海馬神經(jīng)發(fā)生障礙有關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(BFGF)被證實(shí)能促進(jìn)胚胎或成年神經(jīng)干細(xì)胞的分裂增殖〔2〕。但PSD的發(fā)病及電針治療機(jī)制是否與海馬BFGF和EGF表達(dá)變化有關(guān)，尚有待研究。本實(shí)驗(yàn)擬分析電針對(duì)PSD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar大鼠40只，購(gòu)于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)0102016。均為雄性，體重280～320 g，自由飲食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針治療組，每組10只，采用Open-field法進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.2試劑儀器 G6805電針儀(上海華誼儀器制造廠生產(chǎn))，曠場(chǎng)及記錄儀(上海移數(shù)動(dòng)物學(xué)系統(tǒng))，兔抗大鼠EGF、BFGF多克隆抗體，生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(jī)(宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)，HM-325石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，CX40生物顯微鏡(日本olympus公司)。

1.3模型制備 腦卒中模型制備和PSD模型制備。腦卒中模型制備參照王蕊等〔3〕推薦的方法對(duì)模型組、電針治療組進(jìn)行造模，將大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)并分離出迷走神經(jīng)。隨即用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉CCA，夾閉10 min再通20 min，再夾閉10 min。青霉素粉劑局部消毒再縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程同上，但不夾閉CCA。正常組不做任何處理。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)Horner征。PSD模型制備參照洪燈等〔4〕的方法，對(duì)腦卒中模型成功的大鼠予以慢性溫和應(yīng)激(CUMS)制備PSD模型。具體操作：①夾尾1 min；②禁水17 h；③4℃強(qiáng)迫游泳5 min；④持續(xù)光照17 h；⑤水平搖晃5 min；⑥傾斜鼠籠(45°)17 h；⑦濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h；⑧行為限制(束縛)2 h；⑨禁食禁水20 h。9種刺激每日隨機(jī)采取1種，但同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)不間斷刺激21 d。

1.4電針治療方法 進(jìn)行不同時(shí)間周期連續(xù)治療。電針治療組大鼠術(shù)后1 w手術(shù)切口已基本愈合。PSD模型制備成功后傷口已痊愈，開(kāi)始給予電針治療。針刺穴位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔5〕：用28號(hào)30 mm長(zhǎng)毫針，于百會(huì)穴(頂骨正中)斜刺1.67 cm，大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間背部正中)正刺1.67 cm。連接G6805電針儀，施以連續(xù)波，頻率50 Hz，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度(約2.0 rflA)，每天電針1次，留針20 min，連續(xù)治療15 d。

1.5行為學(xué)檢測(cè) 參照林曉春等〔6，7〕的曠場(chǎng)試驗(yàn)法：將大鼠單個(gè)放入開(kāi)野箱的中央格，開(kāi)始記錄其活動(dòng)。以雙后肢穿越一方格邊界記為一次水平運(yùn)動(dòng)，以?xún)汕爸x地且直立記為一次垂直運(yùn)動(dòng)，二者反映動(dòng)物的探究活動(dòng)，檢測(cè)6 min(其中第1分鐘不計(jì)，使大鼠適應(yīng)環(huán)境，共計(jì)5 min數(shù)據(jù))，實(shí)驗(yàn)期間保持環(huán)境安靜與黑暗。及時(shí)清除每只動(dòng)物的排泄物，并噴灑酒精去除箱底、邊異味，各組交替測(cè)試。每只動(dòng)物進(jìn)行1次(1次/6 min)。測(cè)定5 min內(nèi)箱內(nèi)大鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)。曠場(chǎng)試驗(yàn)的水平活動(dòng)反映大鼠運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性水平；垂直活動(dòng)的多少則反映其興趣高低。分別在造模前、造模后和治療后測(cè)定大鼠行為變化。

1.6腦組織生長(zhǎng)因子免疫組織化學(xué)染色方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌注固定后取腦，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g體重)，暴露心臟，先用靜脈套管針經(jīng)主動(dòng)脈用100 ml生理鹽水進(jìn)行沖洗，再灌注由4%多聚甲醛與1%戊二醛組成的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)200 ml，灌注約40 min，灌注完畢后斷頭取大腦組織。將取出的腦組織浸沒(méi)于裝有甲醛固定液管中，并置于-80℃冰箱保存24 h。

石蠟包埋切片制作并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：切片經(jīng)常規(guī)脫臘、脫水、3%過(guò)氧化氫(H2O2)在37℃下處理15 min;微波抗原修復(fù)后滴加10%正常羊血清在37℃下處理 10 min，勿洗;滴加1∶100稀釋的一抗(抗BFGF、EGF)，在4℃下處理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下處理2 h;滴加SABC適量，在37℃下處理1 h;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～10 min;陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，其余步驟相同。每步之間用0.1 mol/L PBS(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常規(guī)脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。結(jié)果判斷：顯微鏡下海馬神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片在400倍顯微鏡下選取4個(gè)視野用 RY-2000瑞醫(yī)病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算其積分光密度〔8〕。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè) 采用SPSS13.10統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組BFGF、EGF積分光密度比較 正常組、假手術(shù)組腦組織見(jiàn)較多EGF和BFGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞;模型組很少，較正常組顯著下降(P<0.05)。電針治療組較模型組EGF和BFGF積分光密度值明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 各組腦組織EGF、BFGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞比較(×400)

表1 各組BFGF、EGF積分光密度比較

與模型組比較：1)P<0.05；同表2

2.2各組水平、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較 正常組與假手術(shù)組水平、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組較正常組和假手術(shù)組明顯減少(P<0.05)，電針治療組較模型組明顯增多(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組水平、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較次)

3 討 論

PSD相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)中“郁證”的范疇，屬于因病致郁〔9，10〕，其病因機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)〔11〕報(bào)道，腦卒中后第1年的PSD發(fā)病率為20%～50%。PSD 不僅影響患者神經(jīng)及肢體功能的康復(fù)，降低生活質(zhì)量及生活滿(mǎn)意度，同時(shí)也增加了腦卒中病死率，給患者親屬帶來(lái)精神和經(jīng)濟(jì)上的極大負(fù)擔(dān)。

目前西藥在PSD的治療中明顯存在副作用嚴(yán)重、起效慢、價(jià)格昂貴等問(wèn)題。中藥方面，肖瀟〔12〕以逍遙散加味為基本方治療，在改善患者中醫(yī)癥狀、對(duì)患者神經(jīng)功能缺損的改善及提高患者日常生活能力方面效果頗好，且起效快，副作用少；陳德仁〔13〕用丹梔逍遙散加減治療PSD，患者癥狀顯著改善，生活自理能力有所提高。Kim等〔14〕發(fā)現(xiàn)電針可改善抑郁狀態(tài)，王忠華〔15〕電針治療PSD，發(fā)現(xiàn)治療效果優(yōu)于口服百憂(yōu)解。針刺作為一種傳統(tǒng)的治療手段正逐漸被接受，其在改善患者臨床癥狀及生活質(zhì)量方面療效確切，已成為藥物治療抑郁癥的有效補(bǔ)充〔16〕。百會(huì)和大椎是2個(gè)益智要穴，位于督脈之上。百會(huì)位居巔頂，為手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈及陰肝經(jīng)之會(huì)，為督脈要穴，百脈聚會(huì)之處，故可調(diào)補(bǔ)中氣，健腦寧神；大椎為“三陽(yáng)督脈之會(huì)”〔17〕。針刺兩穴，可醒腦益智開(kāi)竅、振奮陽(yáng)氣，并達(dá)陽(yáng)以生陰之功〔11〕。以往研究表明，電針百會(huì)、大椎穴有提高腦卒中大鼠海馬神經(jīng)突觸素(Syp)表達(dá)和增加海馬神經(jīng)元數(shù)量的作用，從而增強(qiáng)海馬突觸可塑性，而海馬神經(jīng)突觸可塑性提高與促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生有關(guān)〔18〕。故本實(shí)驗(yàn)選穴以督脈之百會(huì)、大椎為治療穴。

腦卒中發(fā)病時(shí)，腦組織的缺血缺氧使神經(jīng)元能量代謝發(fā)生障礙，引起谷氨酸大量釋放，導(dǎo)致谷氨酸受體過(guò)度活化，產(chǎn)生興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、死亡〔19〕。BFGF主要定位于海馬CA2神經(jīng)元〔20〕，可以作為反映創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞因子；EGF主要定位于嗅球、下丘腦及小腦神經(jīng)元組織中〔21〕。有研究表明BFGF可以促進(jìn)有絲分裂，促進(jìn)微血管的生長(zhǎng)及分化，增加局部毛細(xì)血管數(shù)，促血管生成，在神經(jīng)損傷中保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分裂增殖〔22〕。BFGF不僅能縮小大鼠腦梗死面積，還可以使缺血損傷后的腦血流量顯著增加。在腦缺血損傷的治療中，能使神經(jīng)再生，從而促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)〔23〕。EGF對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞是強(qiáng)力的有絲分裂因子，可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元祖細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖和分化。其還是一個(gè)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可通過(guò)刺激甲狀腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段來(lái)促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)〔24〕。EGF具有與BFGF類(lèi)似的作用，二者不僅具有有絲分裂原的作用，還可促進(jìn)細(xì)胞分化并決定細(xì)胞分化方向，實(shí)驗(yàn)證明BFGF和EGF聯(lián)合使用，可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞化(BMSCs)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞〔25〕。而對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化方向上的影響存在明顯差異，BFGF作用下分化的細(xì)胞主要表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志分子，EGF作用后則主要分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〔26〕。本研究行為學(xué)結(jié)果提示，電針對(duì)PSD大鼠的抑郁治療有效。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，電針對(duì)PSD大鼠神經(jīng)元的修復(fù)與再生有促進(jìn)作用。因抑郁癥患者海馬體積縮小，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，針刺改善PSD大鼠神經(jīng)元的修復(fù)與再生的機(jī)制可能由于提高了海馬神經(jīng)生長(zhǎng)因子BFGF和EGF的含量，從而對(duì)海馬神經(jīng)元的可塑性進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生和神經(jīng)功能的恢復(fù)，這可能是針刺抗抑郁的分子機(jī)制之一，電針對(duì)調(diào)節(jié)PSD大鼠海馬神經(jīng)再生的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究加以明確。