DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4構(gòu)建及免疫BALB/c鼠的效果

張 福 王 楠 姚 敏 何金婷 邵延坤 邢曉娜 徐忠信

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130000)

β淀粉樣蛋白(Aβ)異常聚集在阿爾茨海默病(AD)的起病及進展中起到核心作用〔1〕。免疫治療可能是最有希望阻止和清除Aβ聚集的方法之一。Aβ42肽免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠能夠產(chǎn)生高滴度抗Aβ抗體，減少鼠腦內(nèi)Aβ沉積，并能改善鼠認知功能〔2〕。Aβ疫苗曾因6%的病人出現(xiàn)無菌性腦膜腦炎而被迫停止〔3〕，后認為與抗體無關(guān)〔4〕。本研究擬構(gòu)建DNA疫苗p(Aβ3～10)10-m白細胞介素(IL)-4，并進一步探討其作為AD疫苗的安全性及免疫效果。

1 材料和方法

1.1實驗動物 8周齡BALB/c雄性小鼠18只、10月齡淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1轉(zhuǎn)基因鼠均購于中國醫(yī)科大學實驗動物部。

1.2主要試劑及儀器 質(zhì)粒大量提取試劑盒(OMEGA)；抗Aβ抗體6E10(Signet)；Aβ42肽(AnaSpec)；即用型鏈霉親和素生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德)；ECM830電穿孔儀(美國BTX)等。

1.3p(Aβ3～10)10-mIL-4合成及提取 在GenBank中查找Aβ3～10的cDNA序列。人工合成重復(fù)10次的Aβ3～10的基因片段，在基因的5′端加入GCCACC kozak序列并引入HindⅢ(AAGCTT)的酶切位點，在基因3′端去掉TAG的終止密碼子，加入連接GGGGS的堿基序列GGAGGCGGAGGCTCC，并引入BamHⅠ(GGATCC)的酶切位點。(Aβ3～10)10基因合成后裝載到puc57載體。模板質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-mIL-4購于長沙贏潤生物技術(shù)有限公司。雙酶切(Aβ3～10)10基因片段和pcDNA3.1(+)-mIL-4質(zhì)粒。將酶切后的(Aβ3～10)10基因片段和pcDNA3.1(+)-mIL-4質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，進行質(zhì)粒提取，測序和酶切鑒定正確。用質(zhì)粒大量提取試劑盒進行大量提取。

1.4動物分組及免疫 隨機分成3組，每組6只。p(Aβ3～10)10-mIL-4組免疫p(Aβ3～10)10-mIL-4，100 μg/次，pcDNA3.1(+)組免疫pcDNA3.1(+)，100 μg/次。兩組注射質(zhì)粒前腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mg/kg)，麻醉后在左后肢股四頭肌肌肉注射質(zhì)粒100 μg后用ECM830電穿孔儀進行電穿孔。Aβ42組免疫Aβ42肽50 μg/次，左后肢股四頭肌肌肉注射。3組每3 w免疫1次，共5次。分別在免疫前、第2次免疫開始每次免疫后7 d進行小鼠眼眶后靜脈叢取血。

1.5血清中抗Aβ抗體及分型檢測 抗原包被96孔板。每孔加入100 μl 稀釋的Aβ1～42(5 μg/ml)，4℃孵育過夜。洗板后加封閉緩沖液，室溫下孵育。洗板后每孔加入50 μl稀釋的血清和倍比稀釋的標準抗體6E10。以1∶1 000稀釋免疫前和免疫后的血清。洗板后加入二抗(IgG:1∶2 000； IgG1：1∶2 000； IgG2a：1∶1 000)。洗板后每孔中加入100 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，室溫孵育15 min。每孔中加入100 μl終止液(2N H2SO4)。讀取450 nm處的OD值。

1.6抗血清對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦Aβ斑的識別 10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦組織在4%多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)制備石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水。滅活內(nèi)源性酶。熱修復(fù)抗原。滴加正常山羊血清封閉液。滴加一抗6E10及 p(Aβ3～10)10-mIL-4組免疫前及最后一次免疫后血清。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG。PBS洗后滴加試劑SABC。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

1.7統(tǒng)計方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS12.0進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒p(Aβ3～10)10-mIL-4的構(gòu)建 目的基因(Aβ3～10)10片段成功合成并克隆入pcDNA3.1(+)-mIL-4質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p(Aβ3～10)10-mIL-4：HindⅢ-kozak序列-(Aβ3～10)10-GGGGS連接-BamHI-IL-4-EcoRI。經(jīng)酶切及測序證實質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2免疫后血清抗體及分型測定 從第2次免疫開始Aβ42組及p(Aβ3～10)10-mIL-4組產(chǎn)生抗Aβ抗體，隨著免疫次數(shù)增多抗體滴度逐漸增加，第5次免疫后兩組均產(chǎn)生了高滴度的抗Aβ抗體，而Aβ42組抗體滴度顯著高于p(Aβ3～10)10-mIL-4組(P<0.05)，pcDNA3.1(+)質(zhì)粒組未產(chǎn)生抗Aβ抗體(表1)。p(Aβ3～10)10-mIL-4組免疫后產(chǎn)生的抗體以IgG1〔(26.72±2.43)μg/ml〕為主，IgG2a〔(2.86±0.80)μg/ml〕少量。Aβ42組產(chǎn)生的抗體IgG1〔(32.93±4.48)μg/ml)〕和IgG2a〔(28.5±3.91)μg/ml〕相差不多。p(Aβ3～10)10-mIL-4組IgG1/IgG2a比值(9.93±2.49)約是Aβ42組(1.19±0.33)的8倍。

2.3免疫后的抗血清與APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的老年斑相結(jié)合 經(jīng)免疫組織化學染色證實重組質(zhì)粒p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后產(chǎn)生的抗血清能與10月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的老年斑相結(jié)合?？笰β抗體6E10作為陽性對照，而陰性對照，免疫之前的血清則未染出老年斑(圖1)。說明p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后產(chǎn)生的抗體為抗Aβ抗體。

表1 3組免疫前后抗體滴度

與Aβ42組比較：1)P<0.05

圖1 免疫后抗血清與APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠老年斑結(jié)合(×400)

3 討 論

安全有效的AD疫苗不僅需要產(chǎn)生治療作用的抗體水平，還需要避免T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究選擇Aβ3～10作為目的基因片段，已有研究證實Aβ1～15是誘導(dǎo)B細胞體液免疫的主要表位〔5〕，選擇該片段將避免產(chǎn)生T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。同時，研究表明Aβ4～10與抗Aβ抗體的親和性最大〔6〕，而且Aβ3～6(EFRH)能夠影響Aβ原纖維的溶解度和解聚作用，Aβ3也是老年斑Aβ沉積的重要成分，缺少3號位氨基酸將會影響其與抗Aβ抗體的親和性〔7〕。所以，本實驗選用Aβ42N末端Aβ3～10片段為抗原且將Aβ3～10重復(fù)10次以增強其免疫原性。

本研究選擇Th2型細胞因子IL-4作為佐劑。IL-4是由活化Th2細胞分泌產(chǎn)生的免疫調(diào)控因子，能增強B細胞免疫應(yīng)答，是Th2細胞分化的最主要決定因素〔8〕。當Th2型細胞因子同某種疫苗共同使用時，隨著細胞因子表達，會使抗原特異的免疫應(yīng)答向體液免疫應(yīng)答的方向發(fā)展。研究表明將編碼抗原基因與IL-4基因以融合蛋白的形式在體內(nèi)表達可以提高抗原的免疫原性〔9〕。為了進一步增強疫苗免疫原性，選用體內(nèi)電穿孔的基因遞送途徑。體內(nèi)電穿孔是一種新穎的、非病毒載體的基因遞送途徑，能夠使目的基因進入細胞內(nèi)的概率增加，從而提高表達效率，并能夠在肌肉組織中較長時間表達〔10〕。電穿孔導(dǎo)致的輕微組織損傷還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細胞因子和淋巴細胞浸潤，從而提高抗原遞呈，增強機體的免疫應(yīng)答〔11〕。

研究表明，抗Aβ抗體可以通過血腦屏障進入腦內(nèi)，黏附在Aβ沉積物上并激活了周圍的小膠質(zhì)細胞，從而減少鼠腦內(nèi)的老年斑〔12〕。本研究中，DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫BALB/c鼠后產(chǎn)生了較高滴度的抗Aβ抗體。雖然p(Aβ3～10)10-mIL-4組抗體滴度低于Aβ42組，但是其明顯高于pcDNA3.1(+)組。作為AD疫苗，p(Aβ3～10)10-mIL-4產(chǎn)生了足夠的抗Aβ抗體水平〔13〕，而且p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗經(jīng)電穿孔遞送后，將會在肌肉組織中長期表達。本研究中p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗產(chǎn)生的抗體主要為IgG1，Th2型的抗體清除Aβ沉積更有效，而且發(fā)生炎癥反應(yīng)的可能性降低〔14〕。在AD的免疫治療中，誘導(dǎo)明顯的Th2型的免疫反應(yīng)比單純產(chǎn)生高滴度的抗體水平更重要。疫苗免疫后誘導(dǎo)的免疫球蛋白IgG的亞型可以間接反映免疫反應(yīng)是Th1型還是Th2型〔15〕。在BALB/c小鼠，Th2型免疫反應(yīng)主要誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG1抗體，通過產(chǎn)生IL-4、IL-5等細胞因子增強體液免疫反應(yīng)；而Th1型免疫反應(yīng)主要產(chǎn)生IgG2a抗體，產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ、IL-2等細胞因子誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究提示p(Aβ3～10)10-mIL-4免疫后產(chǎn)生的免疫類型為Th2型，這樣就降低了發(fā)生炎癥反應(yīng)副作用的可能性。本研究表明p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗產(chǎn)生的抗體具有明顯的特異性，具備進入轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)，與老年斑相結(jié)合的能力。

總之，本實驗成功構(gòu)建了表達(Aβ3～10)10和mIL-4融合蛋白的DNA疫苗p(Aβ3～10)10-mIL-4。用p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗免疫BALB/c小鼠后產(chǎn)生了較高滴度的抗Aβ抗體，而且產(chǎn)生了Th2型免疫反應(yīng)。p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗具備了安全有效的AD疫苗的基本要求。將在隨后的研究中進一步探討p(Aβ3～10)10-mIL-4疫苗的有效性及安全性。