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    spo0A基因缺失對(duì)克勞氏芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)性能的影響

    2018-12-07 07:32:24原梨萍王瑞明路福平汪俊卿
    中國釀造 2018年11期
    關(guān)鍵詞:克勞淀粉酶芽孢

    原梨萍,肖 靜,王瑞明,路福平*,汪俊卿,李 玉

    (1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 山東省微生物酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250353)

    克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的革蘭氏陽性菌,具有很好的耐受性,能在極端環(huán)境下生長。近年來,芽孢形成及萌發(fā)過程中關(guān)鍵基因的研究[1-2]備受青睞,而克勞氏芽孢桿菌由于其生理特性及基因信息不明確,使其在芽孢方面的研究及工業(yè)上的應(yīng)用較為落后。目前,國內(nèi)外科研人員以模式微生物枯草芽孢桿菌為主對(duì)芽孢形成過程及關(guān)鍵基因的調(diào)控做了大量深入的研究[3-7],其中,以Spo0A、sigma因子及五種磷酸激酶基因的研究居多[8-13]。芽孢的生成是一個(gè)多層次分階段的過程,其中Spo0A是細(xì)胞從營養(yǎng)生長期進(jìn)入芽孢形成時(shí)期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(responseregulatorprotein,RSP),Spo0A-PO4通過結(jié)合到基因“OA-box”序列上可調(diào)節(jié)500多種基因的表達(dá)。

    目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),spo0A基因缺失對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、梭狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)等多種芽孢桿菌的芽孢生成均產(chǎn)生有效的抑制作用[14-16],而且該基因一定程度上影響菌體生物量及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,SANDOVAL NR等[17]敲除梭狀芽孢桿菌spo0A基因后不僅對(duì)芽孢生成產(chǎn)生影響,而且有效提高了菌體生物量及丁醇產(chǎn)量。目前國內(nèi)外關(guān)于spo0A基因缺失影響淀粉酶產(chǎn)量的報(bào)道少見。本實(shí)驗(yàn)通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建spo0A基因缺失菌株,研究發(fā)現(xiàn)spo0A基因的缺失對(duì)菌體生物量、芽孢生成率及淀粉酶活力均產(chǎn)生影響,該基因在菌種改良上可以作為提高淀粉酶產(chǎn)量的靶點(diǎn),對(duì)后續(xù)芽孢缺失型工業(yè)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建具有重要意義,為酶工業(yè)遺傳育種提供了新的選擇,也為高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌工程菌株的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株及質(zhì)粒

    克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)QL-1、含pHT01質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichia coli)JM109:山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2 試劑

    限制性核酸內(nèi)切酶:大連TakaRa公司;氯霉素、Ezup柱式基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒:生工生物工程(上海)有限公司;高純度質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒:北京艾德萊生物科技有限公司;其他試劑均屬于國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基:酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉10g/L、pH 7.0。

    可溶性淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉 5 g/L、可溶性淀粉 2 g/L、pH 7.0~7.2、瓊脂 20 g/L。

    菌體增殖培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇91 g/L。

    菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、山梨醇69 g/L、甘露醇91 g/L。

    上述培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;WFJ7200型可見分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;4380C型電轉(zhuǎn)儀、5804R低溫冷凍離心機(jī):德國Eppendorf公司;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Veriti96孔熱循環(huán)梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)儀:美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;MD2000核酸超微量分光光度計(jì):美國BioFure公司;ZQYZ-CS型恒溫振蕩培養(yǎng)箱:上海知楚儀器有限公司;DYY-12電泳儀:北京市六一儀器廠;UVIEssential V6凝膠成像儀:英國Uvitec公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 引物設(shè)計(jì)

    采用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物,引物信息見表1。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this experiment

    1.3.2 同源重組片段spo0A-Cmr的制備

    同源重組片段spo0A-Cmr的制備流程見圖1。

    圖1 重組菌B.clausii QL-1△spo0A構(gòu)建流程圖Fig.1 Flowchart of recombinant strain B.clausii QL-1△spo0A construction

    spo0A基因的調(diào)?。禾羧.clausii QL-1單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃,200 r/min培養(yǎng)12 h,使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒對(duì)B.clausii QL-1菌體基因組進(jìn)行提取。1μL基因組模板、1μL spo0A F和1μL spo0A R引物、12.5μL 2×HiFi-PCRmaster、9.5μLddH2O組成的25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得堿基長度為418 bp的spo0A基因片段,PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火30s,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min,4℃保存。

    片段Cmr基因的調(diào)取:挑取大腸桿菌JM109單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃,200 r/min培養(yǎng)12 h,使用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒提取pHT01質(zhì)粒。1μLpHT01質(zhì)粒模版、1μL CmrF和1μL CmrR引物、12.5μL 2×HiFi-PCR master、9.5μL ddH2O組成的25μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得長度為1 264 bp的Cmr抗性基因片段,PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸2 min35s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min,4℃保存。

    同源重組片段spo0A-Cmr的制備:使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收所得的spo0A基因片段和Cmr抗性基因片段,首先進(jìn)行第一步重疊PCR,2μL spo0A基因片段和2μL Cmr抗性基因片段互為模板及引物、12.5μL 2×HiFi-PCR master及3.5μL ddH2O組成的25μL反應(yīng)體系進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 35 s,8個(gè)循環(huán);向第一步反應(yīng)液中加入1μL spo0A F和1μL CmrR引物、12.5μL 2×HiFi-PCR master及10.5μL ddH2O進(jìn)行第二步大量PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸3 min 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min,4℃保存。經(jīng)過上述兩步重疊延伸PCR擴(kuò)增得到1648bp的同源重組片段spo0A-Cmr。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收所得的spo0A-Cmr片段,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 同源重組片段spo0A-Cmr回收產(chǎn)物的酶切及濃縮

    采用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ對(duì)所得的spo0A-Cmr片段進(jìn)行酶切,30μL酶切體系:25μL PCR產(chǎn)物、1.5μL Bam HⅠ、3.5μL 10×K Buffer,37℃靜置1.5 h。向酶切產(chǎn)物中加入醋酸鈉(1/10體積,3mol/L)和無水乙醇(25倍體積),混合后-20℃處理20 min,12 000 r/min離心8 min得DNA沉淀;加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇重懸DNA沉淀,12 000 r/mim離心8 min,除去乙醇,37℃風(fēng)干,加入ddH2O重懸,制得300~500 ng/μL的spo0A-Cmr濃縮DNA溶液。

    1.3.4 克勞氏芽孢桿菌B.clausii QL-1感受態(tài)的制備

    電轉(zhuǎn)緩沖液配制:山梨醇91 g/L、甘露醇91 g/L、甘油100 g/L。

    將B.Clausii QL-1單菌落接種于15 mL的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h;將上述菌液以2%接種量轉(zhuǎn)接到50 mL LB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為1.0;4 ℃、8 000 r/min離心8 min收集菌體;電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌3~4次后重懸、分裝,即為制備好的感受態(tài)。感受態(tài)制備過程中均保證4℃條件下操作。

    1.3.5 重組菌B.clausii QL-1△spo0A的構(gòu)建

    25 mg/mL氯霉素的制備:準(zhǔn)確稱取氯霉素溶解于無水乙醇,溶解后過0.22μm濾膜過濾除菌,分裝后于-20℃中保存。

    感受態(tài)與spo0A-Cmr濃縮片段以10∶1(V/V)比例混合,1500 V、5 ms條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,立即加入1 mL的菌體復(fù)蘇培養(yǎng)基,37℃、180 r/min復(fù)蘇4~5 h后涂布于氯霉素終質(zhì)量濃度為25μg/mL的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~24 h,篩選具有氯霉素抗性的菌株。

    1.3.6 陽性重組菌株的鑒定

    以提取到的陽性菌株DNA為模板,spo0A F和CmrR為引物PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,最終獲得陽性重組菌株B.clausii QL-1△spo0A。B.clausii QL-1△spo0A重組菌于LB液體培養(yǎng)基中,在37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)條件下傳代15次,進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。

    1.3.7 出發(fā)菌株及重組菌株芽孢形成檢測(cè)

    將菌株B.clausii QL-1與B.clausii QL-1△spo0A分別以2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)28 h,將菌液于80℃水浴處理10 min。將80℃水浴處理過的出發(fā)菌株菌液稀釋10-6倍、重組菌株菌液不稀釋,同樣分別做三個(gè)平行,取100μL涂布于LB固體平板上,將未處理的出發(fā)菌株及重組菌株的菌液分別稀釋10-6倍,做3個(gè)平行,取100μL涂布于LB固體平板上,上述平板放置于37℃培養(yǎng)12~18 h,用平板計(jì)數(shù)法觀察并清點(diǎn)100μL處理菌液及未處理菌液的芽孢數(shù)及菌體數(shù)(CFU/mL)。芽孢生成率計(jì)算公式如下:

    1.3.8 B.clausii QL-1△spo0A重組菌生長曲線及生物量的測(cè)定

    生長曲線的繪制:挑取菌株B.clausii QL-1與B.clausii QL-1△spo0A單菌落于15mLLB液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12 h,將菌液轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基至初始OD600nm值為0.1左右,繼續(xù)培養(yǎng),每隔4 h取樣4 mL,使用紫外分光光度計(jì)在波長600 nm處測(cè)定吸光度值。

    生物量的測(cè)定:每隔12h取樣10 mL,離心得菌體沉淀,于70℃烘箱烘干至恒質(zhì)量后測(cè)其生物量。

    1.3.9 B.clausii QL-1△spo0A重組菌淀粉酶酶活的測(cè)定

    分別將出發(fā)菌株B.clausii QL-1和重組菌株B.clausii QL-1△spo0A單菌落點(diǎn)涂于可溶性淀粉平板中央,于37℃條件下靜置培養(yǎng)36 h,觀察并比較透明圈大小。分別以2%接種量接種在LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),每隔6 h取樣5 mL,4℃、12 000 r/min離心8 min取上清,按照國標(biāo)GB/T 24401—2009《α-淀粉酶制劑》中所示方法測(cè)定淀粉酶酶活,并按干質(zhì)量進(jìn)行換算為U/g。

    淀粉酶酶活定義:于60℃、pH值為6.0條件下,1 h液化1 g可溶性淀粉的酶量,即為一個(gè)酶活力單位(U/g)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 spo0A基因缺失菌株B.clausii QL-1△spo0A的構(gòu)建

    以B.clausii QL-1出發(fā)菌基因組為模板,spo0A F和spo0A R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖2a。由圖2a可知,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500 bp左右,與理論長度418 bp相符,說明成功獲得spo0A片段;以質(zhì)粒pHT01為模板,CmrF和CmrR為引物PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖2b。由圖2b可知,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1000bp左右,與理論長度1 264 bp相符,說明成功獲得抗性基因Cmr片段;以膠回收所得的spo0A片段和Cmr片段為模板,spo0A F和CmrR為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖2c。由圖2c可知,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 500 bp左右,與理論長度1 648 bp相符,說明成功獲得同源重組片段spo0A-Cmr。將spo0A-Cmr片段經(jīng)Bam HⅠ酶切后進(jìn)行濃縮,測(cè)其質(zhì)量濃度為450ng/μL。將10μL回收片段與100μL的B.clausii感受態(tài)混合進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,涂布于氯霉素抗性LB平板上,挑取陽性轉(zhuǎn)化子,以spo0A F和CmrR為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2d。由圖2d可知,出現(xiàn)特異性目的條帶,表明成功獲得B.clausii QL-1△spo0A重組菌。

    圖2 spo0A-Cmr片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of spo0A-Cmr and colony

    通過連續(xù)傳代15次,以CmrF和CmrR為引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見圖3。由圖3可知,得到擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 000 bp左右,與理論長度1 264 bp相符,說明B.clausii QL-1△spo0A成功導(dǎo)入Cmr抗性基因,以spo0A F和CmrR為引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小同樣于1648bp出現(xiàn)特異性目的條帶,表明重組菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

    圖3 B.clausii QL-1△spo0A重組菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products of recombinant strain B.clausii QL-1△spo0A

    2.2 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

    圖4 spo0A基因缺失對(duì)克勞氏芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of spo0A gene deletion on spore germination of B.clausii

    通過平板計(jì)數(shù)法對(duì)出發(fā)菌株及重組菌株芽孢生成情況進(jìn)行計(jì)算及比較,結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株B.clausii QL-1芽孢萌發(fā)數(shù)為3.93×108CFU/mL,菌體數(shù)為4.67×108CFU/mL,計(jì)算得到出發(fā)菌株B.clausii QL-1芽孢生成率約為84.15%,通過平板計(jì)數(shù)法及顯微鏡觀察,B.clausii QL-1△spo0A均不生成芽孢。結(jié)果表明,spo0A基因是克勞氏芽孢桿菌芽孢萌發(fā)過程中的關(guān)鍵基因。

    2.3 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)菌株生長的影響

    對(duì)出發(fā)菌株B.clausii QL-1及重組菌株B.clausii QL-1△spo0A進(jìn)行了生長規(guī)律分析及生物量測(cè)定,結(jié)果見圖5。

    圖5 spo0A基因缺失對(duì)菌株在LB培養(yǎng)基中生長周期(a)及生物量(b)的影響Fig.5 Effect of spo0A gene deletion on the growth cycle(a)and biomass(b) of strain in LB medium

    由圖5a可知,B.clausii QL-1△spo0A菌株與出發(fā)菌株的生長周期基本保持一致,4~18 h為對(duì)數(shù)生長期,18~28 h為穩(wěn)定期,28 h后進(jìn)入衰亡期。由圖5b可知,在任何時(shí)間段,重組菌株B.clausii QL-1△spo0A生物量均高于出發(fā)菌株B.clausii QL-1,且均在20 h出現(xiàn)最大生物量,分別為3.10 mg/mL、2.50 mg/mL,生物量提高了24%。

    2.4 spo0A基因缺失克勞氏芽孢桿菌對(duì)淀粉酶分泌的影響

    可溶性淀粉平板初篩,重組菌株B.clausii QL-1△spo0A較出發(fā)菌株B.clausii QL-1透明圈增大,重組菌株透明圈與菌落直徑比為2.75,出發(fā)菌株透明圈與菌落直徑比為1.31,說明構(gòu)建菌株較出發(fā)菌株水解淀粉能力更強(qiáng)。進(jìn)一步于LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并測(cè)定淀粉酶酶活,結(jié)果見圖6。由圖6可知,重組菌株B.clausii QL-1△spo0A產(chǎn)淀粉能力高于出發(fā)菌株B.clausii QL-1菌株,且發(fā)酵至72 h時(shí),淀粉酶酶活均達(dá)到最高,分別為1.58×105U/g、0.86×105U/g,較出發(fā)菌株B.clausii QL-1,重組菌株B.clausii QL-1△spo0A淀粉酶酶活提高83.72%。

    圖6 spo0A基因缺失對(duì)淀粉酶酶活的影響Fig.6 Effect of spo0A gene deletion on amylase activity

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)室通過同源單交換技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了克勞氏芽孢桿菌spo0A基因的敲除,構(gòu)建了spo0A基因缺失型菌株B.clausii QL-1△spo0A,并對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行初步研究,發(fā)現(xiàn)spo0A基因缺失型菌株不生成芽孢,且較出發(fā)菌株B.clausii QL-1生物量提高24%,表明spo0A基因不僅是克勞氏芽孢桿菌芽孢形成關(guān)鍵基因,而且也是菌株生長的重要基因,為構(gòu)建芽孢缺失型克勞氏芽胞桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。通過對(duì)B.clausii QL-1△spo0A菌株的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),重組菌株B.clausii QL-1△spo0A較出發(fā)菌株B.clausii QL-1淀粉酶酶活提高83.72%,表明spo0A基因也是克勞氏芽孢桿菌淀粉酶生成的重要相關(guān)基因,該發(fā)現(xiàn)對(duì)高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌類微生物的構(gòu)建具有指導(dǎo)意義。

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