低劑量丙烯酰胺多世代持續(xù)暴露對秀麗隱桿線蟲的損傷作用

屠澤慧，聶文，郭肖穎，蔡克周,*

1. 合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點實驗室，合肥 230009 2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥 230031

丙烯酰胺(acrylamide, AA)是聚丙烯酰胺的單體[1]，廣泛應(yīng)用于造紙、染料、塑料和水處理等工業(yè)過程[2]。AA對動物生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性[3]，還可誘發(fā)小鼠、大鼠和斑馬魚等多種動物腫瘤[4-5]，也是一種可能的人類致癌物(2A類)[6]。2002年，AA最先在普通食用的食物中被發(fā)現(xiàn)，這些AA主要是由食物中游離的天冬酰胺和還原糖在高溫條件通過美拉德反應(yīng)形成[7-8]。美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全委員會對丙烯酰胺暴露進行了評價，認(rèn)為食品是人體丙烯酰胺主要暴露源[9]。而在中國，組織抽查的144個食品樣本中AA檢出率達(dá)43.7%[10]。

盡管由于食品攝入造成AA對人的廣泛暴露，但由于飲食習(xí)慣和食物結(jié)構(gòu)的不同，AA暴露的劑量存在較大差異，就單個人而言每天飲食攝入量多在μg級別，這種飲食水平AA暴露的生物學(xué)毒性研究相對較少。Jin等[11]報道飲食水平的AA暴露可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥，Walters等[12]發(fā)現(xiàn)低水平的AA可以誘發(fā)原代心肌細(xì)胞功能異常，Claudio則認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌和低水平的AA暴露沒有直接的關(guān)聯(lián)[13]?，F(xiàn)有關(guān)于低水平AA生物學(xué)毒性多在離體培養(yǎng)細(xì)胞上開展，存在相對較短的暴露處理時間，而長時間低劑量，特別是飲食水平的AA在生物上的連續(xù)多世代的暴露，在世代上的積累效應(yīng)目前還沒有研究?，F(xiàn)有常規(guī)動物學(xué)模型如小鼠和大鼠相對較長的繁殖周期也限制了這一研究的開展。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是現(xiàn)有毒理學(xué)研究中的一種經(jīng)典模式生物[14]。通過基因改造和新的生物學(xué)終點的嘗試，秀麗隱桿線蟲已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境因子評估和生態(tài)毒理等方面的研究[15-16]。作為一種活體生物模型，其3～4 d相對較短的生殖周期和4周左右的壽命[17]，是一種開展化學(xué)污染物多世代持續(xù)暴露生物學(xué)毒性評價的好模型，選取簡單、直接、易測的生物學(xué)終點是利用好模式生物的重要前提，線蟲發(fā)育狀況、繁殖性能、壽命和攝食行為等生物學(xué)終點被廣泛應(yīng)用于重金屬[18]、農(nóng)殘[19]、化學(xué)藥物[20]、空氣負(fù)離子[21]和活性提取物[22]的毒理和活性評價。本實驗選擇秀麗隱桿線蟲發(fā)育周期、后代數(shù)量、壽命和攝食行為為生物學(xué)終點，研究低濃度AA多世代持續(xù)暴露的生物學(xué)毒性，為AA合理評估提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與線蟲

AA(超純級，≥ 99.9%)購買于阿拉丁試劑公司，使用時先配制成0.1 mol·L-1溶液過濾滅菌后分裝在1.5 mL離心管，每次使用前取樣稀釋。

實驗所用的野生型秀麗隱桿線蟲N2和線蟲食物大腸桿菌OP50由國際線蟲中心(CaenorhabditisGenetics Center, CGC)提供。在實驗室里，線蟲正常在(20±1) ℃溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 線蟲的同步化處理[21]

用KM培養(yǎng)液(2.922 g NaCl, 2.236 g KCl，溶于1 000 mL雙蒸水，高壓滅菌)將懷卵成蟲從NGM平板洗下，加入到1.5 mL離心管中，使總體積達(dá)到0.7 mL，然后加入0.3 mL裂解液(5 mol·L-1NaOH∶5% NaClO = 1∶2，V/V，現(xiàn)配現(xiàn)用)，間歇彈擊混勻，裂解結(jié)束后立即在1 400 g離心力下離心，移上清，再用KM清洗2次，最后將蟲卵于KM中過夜孵化，由于沒有添加食物，線蟲全部滯留在L1期。

1.3 線蟲發(fā)育周期的測定

AA暴露對線蟲發(fā)育周期的影響，參照Lin的方法[23]，將7～9只懷卵的成蟲分別移入Ф35 mm含0.0、0.01、0.1和1.0 mmol·L-1AA的NGM平板上培養(yǎng)1 h，收集約30只蟲卵，將成蟲移走，此時記時為0 h，48 h之后每隔2 h在解剖鏡下觀察，直至有新蟲卵出現(xiàn)，間隔時間為線蟲發(fā)育周期。

選取適宜的AA濃度，然后再檢測AA多世代持續(xù)暴露對線蟲發(fā)育周期的影響，將7～9只懷卵的成蟲移入對應(yīng)的NGM板中培養(yǎng)，檢測g0代發(fā)育周期，再挑選7～9只g0代懷孕線蟲進行相同處理，測定g1代發(fā)育周期，g2和g3代發(fā)育周期測定同上。對照組在不添加AA的NGM板上測定。每次試驗至少10個平行處理，重復(fù)3次。

1.4 線蟲壽命的測定

AA暴露對線蟲壽命的影響，參照Lin的方法[23]，將同步化早期成蟲分別單個移入Ф35 mm含0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板上培養(yǎng)，此時記為0 d，以后每天將線蟲移入新的平板，直至不再產(chǎn)卵，為保證有新鮮的食物和穩(wěn)定的AA濃度，每3天將線蟲重新轉(zhuǎn)板，直至死亡，間隔天數(shù)即為壽命。

選取適宜的AA濃度，將單個早期成蟲分別移入對應(yīng)的NGM板中培養(yǎng)，檢測g0代壽命，再從g0下一代中挑選早期成蟲，測定g1代線蟲壽命，g2和g3代壽命測定同上，對照組在不添加AA的NGM板上測定。所有在培養(yǎng)期間鉆入瓊脂和爬壁上死亡的都不計入。每次試驗至少15個平行處理，重復(fù)3次。

1.5 線蟲后代數(shù)目測定

AA暴露對線蟲生殖性能的影響，參照Lin的方法[23]，將15只同步化早期成蟲分別單個移入Ф35 mm含0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板中，1 d后將成蟲移入新板，以保證不被后代線蟲所混淆，直到線蟲停止產(chǎn)卵，線蟲在NGM板上所產(chǎn)蟲卵經(jīng)培養(yǎng)1 d后對孵化線蟲進行計數(shù)，即為后代數(shù)量。

選取適宜的AA濃度，將單個早期成蟲移入對應(yīng)的NGM板中培養(yǎng)，測定g0代線蟲后代數(shù)量，再從g0下一代中挑取早期成蟲，測定g1代后代數(shù)量，g2和g3代后代數(shù)量測定方法同上，對照組在不添加AA的NGM板上測定。每次試驗至少10個平行處理，重復(fù)3次。

1.6 攝食行為能力檢測

AA暴露對線蟲攝食行為能力的影響，參考Kohra的方法[24]。將同步化L1期的線蟲分別加入到含有0.0、0.001、0.01和0.1 mmol·L-1AA的NGM板中，暴露培養(yǎng)48 h后，用KM培養(yǎng)液將線蟲洗下，1 000 r·min-1離心1 min沉淀，移取約30只線蟲在專用NGM培養(yǎng)皿上測試。所述測試培養(yǎng)皿如圖1，Ф90 mm中下部設(shè)置一起始點，距起始點4 cm豎直方向上涂出半徑為1 cm的一個菌落目標(biāo)圈，并添加0.05 mol·L-1的NaN3，使得進入菌面采食的線蟲麻醉不能爬出，移取的線蟲添加到起始點，8 h后利用顯微鏡觀察目標(biāo)圈內(nèi)的線蟲數(shù)目。每次試驗至少15個平行處理，重復(fù)3次。

捕食率=(接觸目標(biāo)圈的線蟲數(shù)目/測試培養(yǎng)皿中線蟲總數(shù))×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 軟件ONEWAY-ANOVA進行分析，組間差異顯著性采用Duncan法比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。試驗結(jié)果采用OriginPro 7.0畫圖。

圖1 線蟲采食能力測試培養(yǎng)皿示意圖Fig. 1 The schematic of the nematode feeding ability test dish

2 結(jié)果(Results)

2.1 低劑量AA多世代持續(xù)暴露延長線蟲的發(fā)育周期

不同濃度AA暴露對線蟲發(fā)育周期的影響如圖2(A)所示，隨著AA濃度的增加，線蟲發(fā)育周期呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)AA濃度增加到1.0 mmol·L-1時，線蟲的發(fā)育周期為(69.8±2.5) h，顯著高于對照組的(63.8±1.8) h(P<0.05)，表明較高劑量的AA暴露能阻滯線蟲的正常發(fā)育。為了研究低劑量AA多世代持續(xù)暴露對線蟲發(fā)育周期的影響，選擇了對g0代線蟲發(fā)育沒有影響的0.01 mmol·L-1AA對線蟲連續(xù)暴露4代，結(jié)果如圖2(B)，隨著暴露世代的增加，線蟲發(fā)育周期呈延緩趨勢，而對照組沒有明顯變化。AA持續(xù)暴露至g2代時，線蟲發(fā)育周期明顯長于對照組(P<0.05)，表明低劑量AA對線蟲發(fā)育阻滯作用能在世代間累積，多世代持續(xù)暴露可以誘發(fā)更大發(fā)育損傷。

圖2 丙烯酰胺(AA)暴露對線蟲發(fā)育周期的影響注：(A)不同濃度AA暴露對線蟲發(fā)育周期的影響；(B)多世代AA暴露對線蟲發(fā)育周期的影響；小寫字母完全不同的表示差異顯著，P<0.05，下同。Fig. 2 Effects of acrylamide (AA) on development period of the nematodeNote: (A) Effects on development period of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on development period of the nematode; the different lowercase letters indicate a significant difference, P<0.05. The following is the same.

圖3 AA暴露對線蟲壽命的影響注：(A)不同濃度AA暴露對線蟲壽命的影響；(B)多世代AA暴露對線蟲壽命的影響。Fig. 3 Effects of AA on life span of the nematodeNote: (A) Effects on life span of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on life span of the nematode.

2.2 低劑量AA多世代持續(xù)暴露縮短線蟲壽命

不同濃度AA暴露對線蟲壽命的影響如圖3(A)顯示，隨著AA暴露濃度的增加，線蟲壽命逐漸縮短，表明線蟲受到的損傷逐步加劇。在0.0001 mmol·L-1濃度時，線蟲平均壽命(21.6±1.1) d，與對照組(22.8±0.75) d差異不顯著(P<0.05)，在0.001 mmol·L-1濃度時，線蟲平均壽命已縮短至(18.1±1.1) d，顯著低于對照組(P<0.05)。進一步選取對g0代線蟲壽命沒有影響的0.0001 mmol·L-1AA對線蟲持續(xù)暴露4世代，研究多世代持續(xù)暴露對線蟲壽命的影響，如圖3(B)所示，0.0001 mmol·L-1AA條件下，連續(xù)暴露2代后，線蟲壽命為(17.2±1.25) d，相比較對照組(21.6±1.5) d顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，AA對壽命的影響作用可以在世代間累積，隨著暴露世代的增加，低濃度仍然可以誘發(fā)損傷，導(dǎo)致壽命縮短。

2.3 低劑量AA多世代持續(xù)暴露降低線蟲后代數(shù)量

不同濃度AA對線蟲生殖系統(tǒng)的損傷作用如圖4(A)所示，隨著AA濃度的增加，后代數(shù)量呈現(xiàn)減少趨勢，當(dāng)濃度增加至1.0 mmol·L-1時，線蟲后代數(shù)量從對照組272±26降低到220±18，差異顯著(P<0.05)。在AA多世代持續(xù)暴露試驗中，我們選擇了對g0后代數(shù)量沒有影響的0.01 mmol·L-1AA對線蟲持續(xù)暴露4世代，結(jié)果如圖4(B)所示，線蟲經(jīng)0.01 mmol·L-1AA持續(xù)暴露2世代后，在g1代，平均后代數(shù)量由對照組268±22減少到218±20，差異顯著(P<0.05)，表明低劑量AA多世代持續(xù)暴露可以誘導(dǎo)生殖損傷，導(dǎo)致后代數(shù)量減少。

圖5 AA暴露對線蟲攝食行為的影響注：(A)不同濃度AA暴露對線蟲捕食行為的影響；(B)多世代AA暴露對線蟲攝食行為的影響。Fig. 5 Effects of AA on feeding ability of the nematodeNote: (A) Effects on brood size of the nematode with different concentration of AA; (B) Effects of multiple generations AA exposure on feeding ability of the nematode.

2.4 低劑量AA多世代持續(xù)暴露對線蟲攝食行為能力的影響

不同濃度AA對線蟲捕食行為能力的影響如圖5(A)所示，隨著AA暴露濃度的增加，線蟲捕食行為能力呈現(xiàn)退化趨勢，在0.05 mmol·L-1濃度下，暴露8 h后，線蟲對食物的攝食率從對照組68.8%±4.5%，降低到54.6%±2.0%，差異顯著(P<0.05)。進一步選擇對g0代攝食行為能力沒有影響的0.005 mmol·L-1AA對線蟲持續(xù)暴露4世代，結(jié)果如圖5(B)所示，在持續(xù)暴露2世代后，g1代線蟲捕食行為能力較對照組下降明顯(P<0.05)。表明低劑量AA多世代持續(xù)暴露同樣可以誘發(fā)線蟲捕食行為能力的退化。

3 討論(Discussion)

線蟲發(fā)育周期、后代數(shù)量、壽命和攝食行為能力是AA慢性暴露毒性良好生物學(xué)終點。Jonker等[25]以生殖能力、發(fā)育周期、生殖期和體長為生物學(xué)終點，研究了重金屬銅和鎘離子急性暴露對線蟲的生物學(xué)毒性。Anderson等[26]研究發(fā)現(xiàn)鉛和銅暴露可以影響線蟲食道球跳動頻率，食道球跳動頻率隨著毒物濃度的增加而降低，并伴隨線蟲攝食率的減少。Li等[27]考察了10～500 mg·L-1AA暴露對線蟲攝食行為能力的影響，發(fā)現(xiàn)攝食行為能力可以作為AA暴露損傷檢測生物學(xué)終點。上述關(guān)于生殖能力、發(fā)育周期、生殖期、體長和攝食等生物學(xué)終點的應(yīng)用多為10 mg·L-1濃度以上化學(xué)污染物的急性暴露實驗，在低濃度慢性暴露上，Hasegawa等[28]研究了極低濃度AA慢性暴露對線蟲壽命的影響，發(fā)現(xiàn)1 μg·L-1的濃度即可誘發(fā)線蟲壽命的明顯縮短。在本試驗中，在0.001 mmol·L-1(約71 μg·L-1)濃度下AA可誘發(fā)壽命顯著縮短，與Hasegawa報道的劑量的區(qū)別原因可能有2個方面，一是Hasegawa研究中線蟲在幼蟲L1期就開始染毒暴露，而本研究中在發(fā)育到早期成蟲時才開始暴露，幼蟲染毒可以誘發(fā)更大的危害；另一方面，盡管是相同品系，但是不同的飼養(yǎng)代數(shù)和飼養(yǎng)環(huán)境可以造成線蟲生物學(xué)機能方面的差異。本試驗中，首先研究了不同劑量(0.0001～1.0 mmol·L-1)AA對線蟲的發(fā)育周期、后代數(shù)量、壽命和攝食行為能力的效應(yīng)，顯示AA暴露對線蟲的損傷具有明顯的劑量效應(yīng)，而且，不同生物學(xué)終點對AA的敏感程度也有差異，0.001 mmol·L-1即可誘發(fā)壽命顯著縮短，而對發(fā)育周期和后代數(shù)量產(chǎn)生顯著影響的劑量為1.0 mmol·L-1，對攝食行為能力產(chǎn)生顯著影響的劑量為0.05 mmol·L-1，以壽命最為敏感，捕食行為次之，發(fā)育和后代數(shù)量相當(dāng)。對于多世代持續(xù)暴露試驗，選取在當(dāng)世代不能誘發(fā)顯著損傷效應(yīng)的AA濃度進行4世代暴露，0.0001 mmol·L-1的AA在第1代即可誘發(fā)衰老加速，0.01 mmol·L-1AA分別可在第1代和第2代誘發(fā)發(fā)育和繁殖的損傷，0.005 mmol·L-1AA可在第1代引起捕食行為的損傷，以壽命生物學(xué)終點最為敏感，攝食行為能力、發(fā)育和后代數(shù)量敏感程度依次降低，這一結(jié)果與當(dāng)世代暴露結(jié)果相近。這些結(jié)果表明線蟲發(fā)育周期、后代數(shù)量、壽命和攝食行為能力可以作為AA暴露毒性評價的生物學(xué)終點。

AA暴露生物學(xué)毒性在世代間具有累積作用?，F(xiàn)有研究證實AA暴露可以誘發(fā)多種生物學(xué)毒性，Sarocka等[29]研究證實AA亞急性暴露可以抑制小鼠初級骨血管直徑，造成小鼠骨骼組織發(fā)育損傷，Beland等[30]發(fā)現(xiàn)AA暴露可以誘發(fā)大鼠哈德氏腺和肺等多種組織腫瘤。Hasegawa等[28]報道AA可以誘發(fā)線蟲壽命縮短、成蟲體長縮短。Li等[27]報道AA可有誘發(fā)線蟲食道球跳動頻率降低，攝食率下降，其原因可能與AA誘發(fā)多巴胺神經(jīng)元的功能退化有關(guān)。這些研究多是不同劑量水平對染毒生物當(dāng)世代的損傷效應(yīng)。本試驗研究了低劑量化學(xué)污染物AA多世代持續(xù)暴露對線蟲的生物學(xué)毒性，選取對于當(dāng)世代線蟲不能誘發(fā)生物學(xué)毒性的劑量，觀察在多世代連續(xù)暴露4世代可能誘發(fā)顯著的損傷，如0.005 mmol·L-1水平的AA對g0代線蟲捕食行為沒有影響，但持續(xù)暴露2世代后，在g1代即可誘發(fā)明顯的損傷，與之相似還有0.01 mmol·L-1水平的AA對g0代線蟲發(fā)育周期沒有影響，持續(xù)暴露3世代后，在g2代可誘發(fā)發(fā)育周期明顯延長，而對于壽命在0.0001 mmol·L-1暴露水平下，在持續(xù)暴露2世代后，在g1時代即檢測到壽命明顯的縮短，這些結(jié)果表明了AA生物學(xué)毒性在世代間逐步的積累，持續(xù)的多代低劑量暴露也一定程度上抑制了后代自身的回復(fù)作用，最終積累到一定程度形成明顯的生物學(xué)損傷。另外，AA作為一種常見的食源性化學(xué)污染物，Walters等[12]和Tardiff等[31]通過對人均食物攝取AA估算每天AA攝入量，推測人體血液AA濃度達(dá)0.001 mmol·L-1，而本試驗中0.001 mmol·L-1可誘發(fā)當(dāng)代線蟲壽命的損傷，0.0001 mmol·L-1持續(xù)暴露2世代就可誘發(fā)壽命的顯著縮短，這一結(jié)果提示AA多世代持續(xù)的暴露生物學(xué)毒性值得更多關(guān)注。

總之，AA暴露會對線蟲造成損傷，如影響正常發(fā)育、加速衰老、損傷行為能力、降低后代數(shù)量等，同時，本研究表明秀麗隱桿線蟲可以作為一種較好的活體生物體系用來評估AA慢性多世代持續(xù)暴露的生物學(xué)損傷作用。