均分等效面設計法的建立及其用于三組分混合物等效面的構(gòu)建

葛會林，陶珊珊，朱祥偉，袁宏球,#，呂岱竹

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，?？?571101 2. 華中農(nóng)業(yè)大學 植物科學技術(shù)學院，武漢 430070 3. 青島農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，青島 266109

大量事實表明人類和所有其他生命體在環(huán)境中都暴露于多個組分的化學混合物中。環(huán)境中污染物的混合物對生物的毒性表現(xiàn)為聯(lián)合毒性[1]。人類在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也有目的地利用這種聯(lián)合效應，常將2種、3種或更多種不同農(nóng)藥制劑(包括助劑)配制成混合物施用。如溴氰菊脂與敵敵畏混用防治棉蚜，氯氰菊酯與滅多威混用防治棉鈴蟲[2]，多菌靈、腐霉利與嘧菌酯混配的殺菌劑防治鐵皮石斛植物病害[3]等。農(nóng)藥混用可以提高藥效、減緩病蟲害對藥劑的抗性，在化學防治有害生物方面具有重要的作用。

對于農(nóng)藥混用、復合污染等情況中混合物導致的加和、協(xié)同與拮抗效應的毒性相互作用，通常基于濃度加和(concentration addition, CA)作為加和性參考模型進行評估[4]。CA模型目前已成為混合物毒性預測與評估的金標準[5]。CA模型在笛卡爾坐標空間可表示為圖形，對于二元混合物是直線形式的等效線，對于三元混合物則是平面三角形形式的等效面。等效線和等效面表示的優(yōu)勢在于可對不同濃度比例混合物的毒性相互作用進行綜合圖形展示。效應面在混合物中一般有2種表現(xiàn)形式，一種是在二元混合物中各點效應不相等的面[6]，另一種是在三元混合物中各點效應相等的面[7]。

為了使觀測點在圖形空間均勻全面分布，需要使用優(yōu)化試驗設計配制混合物。直接均分射線法(EquRay)[8]和中心復合設計法[9]證明是高效的設計二元組分濃度配比的方法，可系統(tǒng)設計數(shù)個混合物點以全面表征二元混合物體系的濃度分布進而全面考察二元混合物的毒性變化規(guī)律，方法簡單直觀。對于三元混合物，目前試驗次數(shù)最少的方法是采用均勻設計方法，如劉雪等[10]應用均勻設計法構(gòu)建了5個不同濃度配比的混合物射線，分別研究了3種除草劑及3種殺蟲劑構(gòu)成的三元混合物體系的三維等效面。均勻設計被證明是在化學物混配設計中最有效的方法[11-12]，其突出優(yōu)點是試驗次數(shù)很少、普適性好，能用于三元、六元甚至十元以上混合物的設計[13]。但對于三元混合物，均勻設計的缺點是缺少像直接均分射線法那樣直觀的空間幾何意義。受直接均分射線法對二元組分等效線進行均勻分割設計的啟發(fā)，本研究擬提出均分等效面設計(EESD)方法對三元組分等效面進行均勻分割，實現(xiàn)三元組分濃度配比的優(yōu)化設計，同時顯現(xiàn)其對等效面的空間幾何意義。

化學物毒性檢測一般使用酶、細菌、細胞、藻類、魚等來表征污染物的毒性。酶抑制法相比生物檢測具有操作簡單、重復性好、測試時間短等優(yōu)點。乙酰膽堿酯酶(AChE)最常用于酶抑制法當中，其基本原理是AChE催化底物乙酰膽堿(ATCh)水解得到膽堿，膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應，生成黃色物質(zhì)5-硫代-2-硝基-苯甲酸，通過在412 nm檢測此黃色物質(zhì)的吸光度變化來反映酶催化反應的變化[14]。有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對AChE有抑制作用，兩者反應生成共價結(jié)合的磷?；憠A酯酶或可水解的氨基甲酰化膽堿酯酶。離子液體(IL)因其低揮發(fā)性可望作為揮發(fā)性有機溶劑的替代品，文獻報道IL對生物也能導致毒性[15]，包括對AChE也有抑制作用[16]。

本研究選擇有機磷敵敵畏、氨基甲酸酯滅多威、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)作為代表化學物，使用建立的EESD方法配制三元混合物，測定混合物對AChE的抑制毒性，建立混合物觀測的等效面，通過比較觀測與CA預測的等效面分析混合物毒性相互作用，最終驗證EESD方法的實用性與有效性。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

Synergy2型多功能微孔板測定儀(美國BioTek公司)，AL204型四位電子天平(梅特勒-托利多公司)，雷磁PHS-3E型pH計(上海精密科學儀器有限公司)，96孔透明微板(Corning 9018)。

碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)、DTNB與電鰻AChE等3種物質(zhì)相關(guān)的具體信息見表1。DTNB、ATCI和AChE溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.025 mol·L-1KH2PO4與0.025 mol·L-1Na2HPO4·12H2O)并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，參考文獻[14]，每克DTNB中添加0.379 g的NaHCO3。受試化合物[BMIM]BF4、滅多威(MTM)與敵敵畏(DDVP)分別溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液并避光保存于4 ℃冰箱中。

表1 實驗中化學物質(zhì)的相關(guān)信息Table 1 Information about chemicals used in the experiment

注：乙酰膽堿酯酶(電鰻)分子結(jié)構(gòu)彩圖來源于網(wǎng)址www.rcsb.org/3d-view/1C2O/1。

Note： The molecular structure of acetylcholinesterase (Electrophoruselectricus) was from the website www.rcsb.org/3d-view/1C2O/1.

表2 單個物質(zhì)及三元(G0～G9)與二元(B1～B15)混合物抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應模型及相關(guān)參數(shù)Table 2 Dose-response model of single substances and ternary (G0-G9) and binary (B1-B15) mixtures inhibiting acetylcholinesterase and related parameters

注：pi是混合物中組分的濃度分數(shù)；TU是以EC50計的毒性單位；c0是儲備液濃度；a是位置參數(shù)；b是斜率參數(shù)；R2是決定系數(shù)；RMSE是均方根誤差；EC80、EC50、EC20分別是產(chǎn)生80%、50%、20%效應時的濃度；c0、EC80、EC50、EC20的單位均為mol·L-1；pi與TU比中的整數(shù)0表示對應化合物不存在。

Note：piis concentration proportion of components in mixtures; TU is the toxic unit by EC50; c0is stock concentration;ais location parameter;bis slope parameter;R2is coefficient of determination; RMSE is root mean square error; EC80, EC50, and EC20are the 80%, 50%, 20%-effect concentration, respectively; all the units ofc0, EC80, EC50, and EC20are mol·L-1; Integer 0 inpiand TU ratio means that the corresponding component does not exist.

1.2 均分等效面設計與等效面構(gòu)建

對于三元混合物，本研究提出EESD法進行混合配比。如圖1所示，在組分a、b、c的濃度軸上點出3個組分的EC50，A點坐標為(EC50,a，0，0)，B點坐標為(0，EC50,b，0)，C點坐標為(0，0，EC50,c)，這3點兩兩連接構(gòu)成CA等效面，每兩點所連直線為CA等效線。將3條等效線均分為3段，各均分點坐標分別為D(2EC50,a/3，EC50,b/3，0)、E(EC50,a/3，2EC50,b/3，0)、F(0，2EC50,b/3，EC50,c/3)、H(0，EC50,b/3，2EC50,c/3)、I(EC50,a/3，0，2EC50,c/3)、J(2EC50,a/3，0，EC50,c/3)。從D、E、F、H、I、J點分別作對面2條等效線的平行線，從而將等效面均分為9個全等三角形。

這9個小三角形的重心坐標分別為G1(EC50,a/9，EC50,b/9，7EC50,c/9)、G2(4EC50,a/9，EC50,b/9，4EC50,c/9)、G3(2EC50,a/9，2EC50,b/9，5EC50,c/9)、G4(EC50,a/9，4EC50,b/9，4EC50,c/9)、G5(7EC50,a/9，EC50,b/9，EC50,c/9)、G6(5EC50,a/9，2EC50,b/9，2EC50,c/9)、G7(4EC50,a/9，4EC50,b/9，EC50,c/9)、G8(2EC50,a/9，5EC50,b/9，2EC50,c/9)、G9(EC50,a/9，7EC50,b/9，EC50,c/9)。將這9個小三角形的重心坐標對應于3個組分的9個濃度配比，設計組分毒性單位比依次為1:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1。

另外，按照慣例設計3個組分的EC50比混合物射線，對應于等效面ABC三角形的重心G0(EC50,a/3，EC50,b/3，EC50,c/3)，其毒性單位比為1:1:1，又稱等毒性濃度比混合物射線。這里需要指出，三元組分在三維濃度空間中的一個點可稱為混合物點，組分比例相同的點構(gòu)成一條混合物射線，所有的混合物射線構(gòu)成一個混合物體系[17]。

圖1 均分等效面設計法設計混合物示意圖Fig. 1 Ternary mixture design using equipartition equivalent-surface design method

得到混合物體系觀測等效點后，采用基于三角形的三次插值得到混合物x%效應的觀測等效面?；驹硎且匀切螢榛A的三次方程內(nèi)插，即先按Delaunay三角剖分算法找出內(nèi)插點四周的3個點，構(gòu)成三角形，然后使用三次方程將點內(nèi)插在三角形內(nèi)[18-19]。具體實現(xiàn)這個過程的Matlab代碼如下：

x=[…];

y=[…];

z=[…];

mx=min(x); %求x的最小值

Mx=max(x); %求x的最大值

my=min(y); %求y的最小值

My=max(y); %求y的最大值

Nx=50; %設置x軸插值數(shù)據(jù)點數(shù)

Ny=50; %設置y軸插值數(shù)據(jù)點數(shù)

cx=linspace(mx, Mx, Nx); %在原始x數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間隔生成Nx個插值點

cy=linspace(my, My, Ny); %在原始y數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間隔生成Ny個插值點

cz=griddata(x,y,z, cx, cy', 'cubic'); %調(diào)用基于三角形的三次方程進行插值

mesh(cx, cy, cz); %繪制三維網(wǎng)格曲面

1.3 混合物設計

基于[BMIM]BF4、滅多威與敵敵畏的儲備液濃度(c0)與EC50，按照前述建立的EESD法進行三者毒性單位比1:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1設計G1～G9共9條三元混合物射線。同時按照經(jīng)典方法設置一個EC50比三元混合物射線G0。對于二元混合物，按照直接均分射線法[8]進行毒性單位比1:5、2:4、3:3、4:2、5:1兩兩混合設計，得到B1～B15二元混合物射線，其中B3、B8、B13為等毒性濃度比混合物射線。這些混合物射線中各組分的濃度分數(shù)見表2。

1.4 乙酰膽堿酯酶微板毒性分析

參考發(fā)光菌微板毒性分析法[20]與AChE酶抑制法[14]，建立基于AChE的微板毒性分析法[21]，具體分析程序如下。將96孔微板第12列的8個孔加入100 μL磷酸鹽緩沖液作為空白對照，其余11列加入按稀釋因子0.5設計的11個濃度梯度污染物100 μL，每個濃度8個重復，接著每孔依次加入50 μL 1 g·L-1DTNB、50 μL 1 g·L-1ATCI、50 μL 0.2 U·mL-1AChE，每孔總體積共250 μL，然后將微板送入酶標儀于412 nm下測定0 min與15 min的OD值，全程使用空調(diào)控溫(29±1) ℃。

圖2 單個物質(zhì)抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應曲線注：□空白控制；○觀測數(shù)據(jù)點；—Weibull模型擬合線；┄置信區(qū)間。Fig. 2 Dose-response curves of single substances inhibiting acetylcholinesteraseNote: □ Blank control; ○ Observed data; — Weibull model fit; ┄ Confidence interval.

污染物對AChE的抑制毒性E按照公式(1)計算，得到的劑量-效應曲線(DRC)使用公式(2)所示W(wǎng)eibull函數(shù)進行最小二乘法擬合并計算95%的觀測置信區(qū)間[22]，得到效應濃度如EC80、EC50、EC20等。

E=1-△ODt/△ODc

(1)

E=1-exp(-exp(a+b×log10(C)))

(2)

式中ΔODt為處理溶液0～15 min的吸光度變化值，ΔODc為對照溶液0～15 min吸光度變化值，E為效應，C為濃度，a為位置參數(shù)，b為斜率參數(shù)。

1.5 混合物毒性預測與評估

使用公式(3)所示濃度加和(CA)模型進行混合物毒性的預測與評估。式中n是混合物的組分數(shù)，ci是產(chǎn)生效應x%的混合物中組分i的濃度，ECx,i是組分i單獨引起x%效應時的濃度。

(3)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 單個化合物劑量-效應曲線分析

從圖2可以看出，[BMIM]BF4、滅多威、敵敵畏對AChE抑制毒性的DRC呈良好的S型曲線，空白變異在測試中控制在了±10%以內(nèi)。DRC經(jīng)最小二乘法回歸的統(tǒng)計參數(shù)見表2，均方根誤差(RMSE)均小于0.03，決定系數(shù)(R2)均大于0.99，單個物質(zhì)DRC可用Weibull函數(shù)有效表征。擬合得到的關(guān)鍵參數(shù)如DRC位置參數(shù)a和斜率參數(shù)b、EC80(80%效應濃度)、EC50(50%效應濃度)、EC20(20%效應濃度)同列于表2。從這3個效應濃度，都可得出對AChE抑制毒性的大小順序為滅多威>敵敵畏>[BMIM]BF4，3種物質(zhì)效應濃度的差距各接近一個數(shù)量級，單個物質(zhì)EC80與EC20的差距也接近一個數(shù)量級。混合物x%效應等效面的頂點坐標分別對應單個組分的效應濃度指標ECx，ECx的精確性能保證構(gòu)建的混合物體系在x%效應的CA等效面的精確性。

毒物對AChE的抑制效應主要與乙酰膽堿、毒物、AChE三者的相互作用有關(guān)。AChE的活性位點有2個結(jié)構(gòu)域，即催化陰離子位點(catalytic anionic site, CAS)和外周陰離子位點(peripheral anionic site, PAS)[23]。毒物分子結(jié)構(gòu)中包括芳香基團和可質(zhì)子化的雜原子時，兩者間滿足一定的空間取向與距離要求就可以產(chǎn)生有效的PAS作用[24]。[BMIM]BF4含咪唑五元芳雜環(huán)，其可能與AChE活性中心帶負電荷的PAS位點結(jié)合。敵敵畏是磷酸酯類有機磷農(nóng)藥，不同于硫代磷酯類必須經(jīng)過活化作用才能發(fā)揮藥效，可直接與AChE活性中心的CAS位點共價結(jié)合且抑制作用不可逆，反應速率快。滅多威是與AChE活性位點以外的部位結(jié)合且結(jié)合是可逆性的，主要是通過改變酶分子的形狀來達到對AChE的抑制，為非競爭性抑制[25]。所以，[BMIM]BF4、滅多威、敵敵畏對AChE抑制具有不同的作用模式。

2.2 基于劑量-效應曲線的混合物毒性分析

圖3為測得的三元混合物射線G0～G9與二元混合物射線B1～B15對AChE的DRC。結(jié)果表明，所有混合物射線的DRC都可用Weibull函數(shù)有效擬合，均方根誤差(RMSE)均小于0.03，決定系數(shù)(R2)均大于0.99。擬合得到混合物的幾個效應濃度EC80、EC50、EC20同列于表2。觀察后發(fā)現(xiàn)，二元或三元混合物的EC80、EC50、EC20都分別位于單個組分EC80、EC50、EC20的最大值與最小值之間。唯一的例外是混合物B11的EC80、EC50、EC20(表2中以*標出)分別大于組分敵敵畏的EC80、EC50、EC20。我們先前的研究證明CA預測的混合物某效應濃度總是位于組分此效應濃度的最大值與最小值之間，如果混合物某效應濃度大于組分此效應濃度的最大值或小于其最小值，混合物理論上將呈現(xiàn)出拮抗或協(xié)同作用[26]。所以，這表明基于CA，B11在80%、50%、20%效應均產(chǎn)生了拮抗效應。

以觀測DRC(指觀測點擬合得到的DRC)的95%置信區(qū)間作為界限，CA預測效應大于置信區(qū)間上限判定混合物呈現(xiàn)拮抗作用，CA預測效應小于置信區(qū)間下限判定混合物呈現(xiàn)協(xié)同作用，CA預測效應位于置信區(qū)間上下限之間判定混合物為加和作用。另外，由于DRC擬合函數(shù)與CA模型的特性，混合物效應趨近于0%或100%時，混合物觀測DRC與CA預測DRC將重合。

綜合來看，G0、G2～G9、B1、B3～B5、B7～B10、B12～B15混合物射線均呈現(xiàn)加和作用，其中G0、G2、G3、G5、B5、B9、B10、B13混合物射線的觀測DRC良好符合CA預測的DRC。剩下4條混合物射線產(chǎn)生了相對明顯的毒性相互作用，G1在效應E<40%時為加和，在E>40%時為拮抗；B2在E<10%或E>40%為加和，在10%85%為加和，在15%95%為加和，在40%

圖3 三元(G0～G9)與二元(B1～B15)混合物抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應曲線注：□空白控制；○觀測數(shù)據(jù)點；—Weibull模型擬合線；CA預測線；┄置信區(qū)間。Fig. 3 Dose-response curves of ternary (G0-G9) and binary (B1-B15) mixtures inhibiting acetylcholinesteraseNote: □ Blank control; ○ Observed data; — Weibull model fit; CA prediction; ┄ Confidence interval.

在本研究中，所有混合物效應低于10%的區(qū)域均為加和作用。這符合Escher等[27]提出的假設，即當單個化合物的濃度遠低于閾值效應同時作用模式不同時，混合物將呈現(xiàn)加和毒性。我們先前研究的離子液體與重金屬對青?；【鶴67的聯(lián)合毒性也符合這個假設[28]。

觀察到一些混合物射線的CA預測DRC與觀測DRC產(chǎn)生了相交，很明顯的如B1、B2、B3混合物射線，Sun等[29]將混合物的DRC曲線穿過模型預測曲線的現(xiàn)象稱為交叉現(xiàn)象，潘永正等[30]對此進行了評述，目前可以認為交叉現(xiàn)象在混合物中是普遍存在的，可能與混合物中復雜的聯(lián)合作用模式有關(guān)。

2.3 基于等效面的混合物毒性相互作用分析

CA理論上預測三元混合物等效面是個平面三角形，三角形頂點分別位于3個組分濃度軸上的ECx濃度點，三角形的三條邊分別對應組分兩兩組合的二元混合物的x%效應的CA等效線。CA預測的G0～G9混合物射線的等效面與B1～B15混合物射線的等效線的具體方程見表3。CA模型是二元混合物等效線和三元混合物等效面的截距方程式表達。

繪制混合物完整的觀測等效面，除了需要組分濃度軸上單個組分的3個ECx點，還需將所有三元與二元混合物的效應濃度ECx乘以各組分濃度分數(shù)后所得組分濃度在空間中對應的x%效應的等效點。這樣三元混合物(G0～G9)共10個點，二元混合物(B1～B15)共15個點，3個組分共3個點。二元混合物所得點構(gòu)成二元混合物等效線上的觀測點，同時構(gòu)成三元混合物觀測等效面的三條邊界。

將上述共28個等效點采用基于三角形的三次插值得到混合物x%效應的觀測等效面(圖4)，其中分別在[BMIM]BF4與滅多威濃度軸上數(shù)據(jù)的最大值與最小值之間等間距設置50個插值點。圖4中三角形為CA預測的三元混合物等效面，三角形3條邊為CA預測的組分兩兩組合的二元混合物的等效線，等效面邊界上分布的5個點對應于二元混合物的觀測等效點。

CA等效面與三維坐標圍成四面體，四面體內(nèi)空間定義為內(nèi)，四面體外空間定義為外。20%、50%、80%效應的等效面將以向外遠離四面體內(nèi)原點的方式依次間隔層疊。以CA等效面作為參考，觀測等效面向內(nèi)凹表示混合物產(chǎn)生協(xié)同作用，向外凸表示混合物產(chǎn)生拮抗作用，這個判定標準同樣適合于等效面邊界的觀測等效線。

圖4中80%與50%效應的等效面具有較為相似的特征，[BMIM]BF4-MTM基本為加和作用。隨著DDVP濃度的增加，[BMIM]BF4-DDVP逐漸由加和轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓梗卓棺饔米顝婞c對應B6混合物射線DRC上的80%、50%的效應點。隨著DDVP濃度的增加，MTM-DDVP逐漸從加和轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓梗卓棺饔米顝婞c對應B11混合物射線DRC上的80%與50%效應點。上述結(jié)果與基于DRC的分析也是一致的。

表3 三元混合物等效面及二元混合物等效線的CA方程Table 3 CA equations of ternary mixture equivalent-surface and binary mixture isobole

注：x是[BMIM]BF4的濃度，y是滅多威的濃度，z是敵敵畏的濃度，濃度的單位是mol·L-1。

Note：xis the concentration of [BMIM]BF4;yis the concentration of methomyl;zis the concentration of dichlorvos; the unit of concentration is mol·L-1.

圖4 三元混合物在80%、50%、20%效應的等效面Fig. 4 Ternary mixture equivalent-surface at the 80%, 50%, and 20% effects

基于等效面分析，G0及G2～G9混合物射線在80%與50%效應水平均為加和作用。但G1混合物點明顯外凸，故對應混合物呈現(xiàn)明顯拮抗效應。DRC分析也表明G1混合物射線在80%與50%效應點呈現(xiàn)拮抗作用。同時相比G0及G2～G9混合物點，G1混合物點與拮抗作用最強的B6、B11二元混合物點距離最近，2條等效線的外凸導致G1混合物點也明顯外凸，即二元混合物拮抗作用較強的區(qū)域?qū)е锣徑鼌^(qū)域的三元混合物點也產(chǎn)生了拮抗作用。由于[BMIM]BF4-DDVP及MTM-DDVP等效線的外凸，加上G1混合物點向外凸，導致在[BMIM]BF4-MTM-DDVP等效面的右上側(cè)形成了一個淺窄的鞍槽。

圖4的20%效應的等效面中，二元混合物的觀測等效線與CA等效線均發(fā)生了不同程度的交叉。隨著DDVP濃度的增加，[BMIM]BF4-DDVP逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓?，拮抗作用最強點對應B6混合物射線的20%效應點。B2混合物射線的20%效應點在[BMIM]BF4-MTM觀測等效線上產(chǎn)生了最強的拮抗效應。MTM-DDVP基本為加和作用。G1點類似地也有輕微的外凸，但不顯著。隨著DDVP的濃度降低，[BMIM]BF4-DDVP與MTM-DDVP等效線逐漸內(nèi)凹，導致等效面也整體以勺子狀內(nèi)凹，結(jié)合圖3中G0～G9的DRC上20%效應點分析，三元混合物總體上呈現(xiàn)加和作用。

G0混合物射線DRC完美符合CA模型，反映在等效面上，G0作為其重心點，是唯一同時距離單個組分點即等效面頂點最遠的點，理論上受三者彼此相互作用的影響也最小，所以最有可能表現(xiàn)為無毒性相互作用或加和作用。

2.4 均分等效面設計法拓展

均分等效面設計(EESD)只需知道單個化合物的EC50，不需知道其他效應濃度水平，即可進行混配優(yōu)化設計。三元農(nóng)藥混配中比例的選擇目前尚無統(tǒng)一的方法。如為防治鐵皮石斛炭疽病，篩選含多菌靈、腐霉利、嘧菌酯的復配殺菌劑的專利配方[3]中，三藥劑質(zhì)量比分別為3:1:4、3:1:12、3:1:1.33、6.75:2.25:1、3:1:36、14.25:4.75:1、3:1:76 (換算后數(shù)值)。若將EESD方法應用于農(nóng)藥混配中，可以直接采用藥劑的質(zhì)量比，從而提供了一種農(nóng)藥混配的優(yōu)化設計方法。EESD對于三元農(nóng)藥或三元藥物的聯(lián)合效應研究具有參考意義。

按照劉雪等[10]的均勻設計方案，將本研究中的[BMIM]BF4、MTM、DDVP三個組分的5個效應濃度(EC10、EC20、EC30、EC40、EC50)作為因素水平，采用U5(54)均勻表中的第1、2、3列設計了5個虛擬的混合物，基于CA模型得到這5個混合物在50%等效面上對應的點(見圖5中黑點)。以最簡單的四均分等效面設計作為對比，其對應的4個重心點見圖5中紅圈?？梢钥闯?，對于等效面，EESD點的分布更為均勻；點的覆蓋范圍也更大一些，這對于繪制完整的等效面是至關(guān)重要的。所以，EESD能最大程度地均勻覆蓋混合物等效面，且具有明確的空間幾何意義。但對于四元以上混合物，均勻設計是為數(shù)不多能用于混合物設計的方法。

試驗設計是在因素可取值的區(qū)域內(nèi)，最有效地采樣試驗點，達到采樣點具有代表性以及采樣點數(shù)在可接受的范圍內(nèi)等目的。EESD即為解決如何在等效面對應的三角形平面內(nèi)高效而有代表性地采樣試驗點為目的。以析因試驗設計作為對比，對于n個試驗因素(化合物)，每個因素m個水平(濃度)，需安排的實驗次數(shù)為mn次。如Charles等[31]應用雌激素受體試驗研究3個組分的混合物毒性，其中每個化合物都以4個濃度水平進行全因子設計，需完成64次實驗。Narotsky等[32]用5×5×5設計研究了乙炔化三氯、鄰苯二甲酸二乙基乙酯和七氯每個化合物5個劑量水平的混合物毒性，需設計125次試驗。而按照本研究中的EESD，這2個例子分別需要25次與36次試驗。這里的相同點是試驗次數(shù)都以指數(shù)冪形式增加，不同點是析因設計的指數(shù)為3，EESD的指數(shù)為2。

所以本質(zhì)上，EESD是一種降維設計方法，將廣闊的三維濃度空間壓縮至二維平面進行試驗設計。隨著等效線分割點數(shù)增加時，如設計1、2、3、4、5個均分點時，EESD的比例總個數(shù)分別為4、9、16、25、36個，試驗次數(shù)增加仍然很快，所以應根據(jù)具體的實驗目的選擇合適的均分數(shù)。

設組分數(shù)為n(n=3)，等效線均分點數(shù)為m(m≥1且為整數(shù))，EESD法的重心坐標為(EC50,a×ea/(n×(m+1))，EC50,b×eb/(n×(m+1))，EC50,c×ec/(n×(m+1)))，

其中ea、eb、ec為EESD設計的TU比中的元素。歸納后得到EESD法構(gòu)造TU比的幾條規(guī)則：

(1)構(gòu)造的比例總個數(shù)或等效面均分數(shù)目Sm,n=(m+1)^(n-1)；

(2)每組比例中元素均為正整數(shù)，且元素之和Se=ea+eb+ec=n×(m+1)；

(3)每組比例中元素e≤n×(m+1)且e≠j×n，其中j=1,…,m。

根據(jù)該規(guī)則進行排列組合可以完全唯一地構(gòu)造出4、9、16、25、36均分等效面設計的比例，具體數(shù)值見表4。但該規(guī)則推廣到更一般的情況還需研究與證明。

圖5 均勻設計(黑點)與均分等效面設計(紅圈)的三元混合物濃度點在等效面上的分布圖Fig. 5 Distribution diagram of ternary mixture concentration points at the equivalent-surface based on uniform design (black dots) and equipartition equivalent-surface design (red circles)

mSm,nSeEESD設計的毒性單位比例Toxic unit ratio designed by EESD1461:1:4、4:1:1、2:2:2、1:4:12991:1:7、4:1:4、2:2:5、1:4:4、7:1:1、5:2:2、4:4:1、2:5:2、1:7:1316121:1:10、4:1:7、2:2:8、1:4:7、7:1:4、5:2:5、4:4:4、2:5:5、1:7:4、10:1:1、8:2:2、7:4:1、5:5:2、4:7:1、2:8:2、1:10:1425151:1:13、4:1:10、2:2:11、1:4:10、7:1:7、5:2:8、4:4:7、2:5:8、1:7:7、10:1:4、8:2:5、7:4:4、5:5:5、4:7:4、2:8:5、1:10:4、13:1:1、11:2:2、10:4:1、8:5:2、7:7:1、5:8:2、4:10:1、2:11:2、1:13:1536181:1:16、4:1:13、2:2:14、1:4:13、7:1:10、5:2:11、4:4:10、2:5:11、1:7:10、10:1:7、8:2:8、7:4:7、5:5:8、4:7:7、2:8:8、1:10:7、13:1:4、11:2:5、10:4:4、8:5:5、7:7:4、5:8:5、4:10:4、2:11:5、1:13:4、16:1:1、14:2:2、13:4:1、11:5:2、10:7:1、8:8:2、7:10:1、5:11:2、4:13:1、2:14:2、1:16:1

注：m為等效線均分點數(shù)，Sm,n為組分數(shù)為n及等效線均分點數(shù)為m的等效面的均分數(shù)目，Se為每組比例中元素之和。

Note：mis the equipartition number of isobole;Sm,nis the equipartition number of equivalent-surface with component numbernand isobole equipartition numberm;Seis the sum of the elements in each set of ratios.

致謝：感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所賈瑞宗博士在文章修改中給予的幫助。感謝審稿人對提高文章質(zhì)量提出的有建設性的修改意見。