QuEChERS-HPLC-MS/MS法分析丙硫菌唑及其代謝物在小麥和土壤中的殘留

孫 星，閆小龍，楊邦保，丁 悅，余向陽*

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（南京），江蘇 南京 210014）

丙硫菌唑是一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，由拜耳公司開發(fā)[1]，主要用于防治由子囊菌、擔(dān)子菌以及半知菌引起的病害[2]，其作用機(jī)理是抑制真菌中甾醇的前體——羊毛甾醇或2,4-亞甲基二氫羊毛甾醇14位上的脫甲基化作用，即脫甲基化抑制劑[3]。丙硫菌唑具有毒性低、無致畸、致突變性、對(duì)胚胎無毒性、對(duì)人和環(huán)境安全等特點(diǎn)，具有很好的內(nèi)吸活性，可以優(yōu)異的保護(hù)、治療和根除活性，并且持效期長(zhǎng)，具有廣譜的殺菌活性[4-5]。2004年上市以來，丙硫菌唑在谷類、麥類、豆類農(nóng)產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用，幾乎對(duì)麥類所有病害，均有很好的防效[6-7]。丙硫菌唑在作物和土壤中的主要代謝物為其脫硫產(chǎn)物硫酮菌唑[8]。目前關(guān)于丙硫菌唑的研究主要集中在毒力測(cè)定[9-10]、合成工藝[4-5,11-13]、田間防治效果[7,14]及含量檢測(cè)分析[15-18]、土壤中的殘留消解及轉(zhuǎn)化研究以及對(duì)其在土壤中的降解規(guī)律進(jìn)行闡述[8]。鮮見丙硫菌唑在小麥中殘留以及降解動(dòng)態(tài)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS樣品前處理方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）檢測(cè)技術(shù)，研究丙硫菌唑及其代謝物在小麥和土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量，為丙硫菌唑在小麥上的施用劑量和安全間隔期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

98.5 %丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品、99%硫酮菌唑標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)） 德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；40%丙硫·戊唑醇懸浮劑（其中丙硫菌唑含量為20%） 溧陽中南化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6470A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；R10.v.v食品切碎攪拌機(jī) 法國(guó)Robot Coupe公司；QL-901渦流混合器 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；AL204十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-200百分之一電子天平常州雙杰電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

40%丙硫·戊唑醇懸浮劑在小麥植株和土壤中降解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)按NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》執(zhí)行[19]，設(shè)有空白對(duì)照區(qū)、低劑量處理區(qū)、高劑量處理區(qū)和消解動(dòng)態(tài)處理區(qū)。降解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)：分別與小麥試驗(yàn)地及空白土壤地均勻施藥。施藥劑量為制劑量75 g/667 m2（450 g a.i./hm2），施藥后2 h，1、3、7、10、14、21、30 d采樣。植株樣本的采集：隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)剪取地表以上的全株（去根）1 kg，切碎、混勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中，黏好標(biāo)簽，備用。土壤樣本的采集：隨機(jī)取點(diǎn)5～10 個(gè)，用土鉆采集0～10 cm的土壤2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，在盆中混合均勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中，黏好標(biāo)簽，備用。最終殘留試驗(yàn)：分別設(shè)50 g/667 m2（300 g a.i./hm2）與75 g/667 m2（450 g a.i./hm2）低高2 個(gè)施藥劑量，施藥2～3 次，施藥間隔期7 d。距離最后1 次施藥的間隔時(shí)間28、35、42 d采樣。植株樣本采集：用隨機(jī)方式在試驗(yàn)小區(qū)中剪取土表以上的全株1 kg，切碎、混勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，黏好標(biāo)簽，備用。小麥籽粒樣本采集：用隨機(jī)方式在小區(qū)中剪取稻穗2 kg，裝入樣本袋中包扎妥當(dāng)，黏好標(biāo)簽，備用。土壤樣本采集：隨機(jī)取點(diǎn)5～10 個(gè)，采用土鉆采集0～15 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，黏好標(biāo)簽，備用。

1.3.2 樣品提取凈化

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加20 mL乙腈，數(shù)顯型多管式旋渦混合器振蕩20 min，經(jīng)5 000 r/min離心，取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，氮吹至干，2 mL色譜甲醇定容，加入100 mg無水硫酸鎂和50 mg C18填料，旋渦振蕩，5 000 r/min離心，取上清液于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.3.3 HPLC-MS/MS檢測(cè)條件

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積2.0 μL；流動(dòng)相及洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Eluent gradient conditions

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速6 L/min；噴霧器壓力25 psi；鞘流氣溫度250 ℃；鞘流氣流速5 L/min；采集參數(shù)見表2。

表2 丙硫菌唑及脫硫代謝物硫酮菌唑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for determination of prothioconazole and prothioconazole-desthio

HPLC-MS/MS測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，組分含量按公式（1）計(jì)算：

式中：Xi為試樣中北側(cè)組分含量/（mg/kg）；Ci為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中被測(cè)組分的質(zhì)量濃度/（mg/L）；M為被測(cè)樣品質(zhì)量/g；Vm為試樣提取液的總體積/mL；V1為試樣移取提取液的體積/mL；V2為試樣定容體積/mL。

1.3.4 降解半衰期的計(jì)算

丙硫菌唑及硫酮菌唑消解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程按公式（2）計(jì)算，降解半衰期按公式（3）計(jì)算[20]：

式中：Ct為t時(shí)刻丙硫菌唑及硫酮菌唑的殘留含量/（mg/kg）；C0為丙硫菌唑及硫酮菌唑的初始質(zhì)量濃度/（mg/L）；k為降解速率常數(shù)/d-1；t1/2為降解半衰期/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

采用甲醇與水的梯度洗脫為HPLC-MS/MS的流動(dòng)相，正負(fù)離子掃描反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)丙硫菌唑與硫酮菌唑，保證丙硫菌唑與硫酮菌唑有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，在正離子檢測(cè)方式下，硫酮菌唑產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+分子離子峰，即m/z 312.1；在負(fù)離子檢測(cè)方式下，丙硫菌唑產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，即m/z 342.0。進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到硫酮菌唑的特征碎片離子為m/z 70.1和m/z 124.9；丙硫菌唑的特征碎片離子為m/z 99.9和m/z 125.0。分別選取m/z 70.1和m/z 99.9為硫酮菌唑和丙硫菌唑的定量離子，m/z 124.9和m/z 125.0為硫酮菌唑和丙硫菌唑的定性離子。

2.2 前處理方法優(yōu)化

圖1 4 種凈化方式下丙硫菌唑（A）及硫酮菌唑（B）在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的回收率情況Fig. 1 Recoveries of prothioconazole (A) and prothioconazole-desthio (B)in wheat grains, wheat straw and soil with four purification methods

乙腈是農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面常用提取溶劑，難以提取農(nóng)作物中糖、蛋白質(zhì)類化合物，對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率[21]，因此選擇乙腈作為本實(shí)驗(yàn)提取試劑，以確保目標(biāo)化合物的有效提取并使提取液中的干擾物較少，本實(shí)驗(yàn)借鑒QuEChERS凈化方法[22-29]，比較了PSA、NH2、C18及GCB 4 種填料在凈化上的效果，如圖1所示，PSA、NH2及GCB填料雖然除雜效果好，但對(duì)丙硫菌唑吸附明顯，影響回收率，C18除雜效果稍弱，但不影響回收率。為保持良好的添加回收率，綜合考慮本實(shí)驗(yàn)使用100 mg無水硫酸鎂和50 mg C18作為QuEChERS處理的吸附劑。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍及檢出限結(jié)果

使用空白溶劑，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1、2、5、10、20、50、100 μg/L和200 μg/L，在1.3.3節(jié)液相色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定，以丙硫菌唑和硫酮菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。其中，丙硫菌唑線性回歸方程為y=83 815x-17.443，r2=0.996 8；硫酮菌唑線性回歸方程為y=94 182x-6.143 3，r2=0.999 8。峰面積與溶液質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。以3 倍信噪比為儀器檢出限，丙硫菌唑及其代謝物的檢出限均為2×10-3ng。

2.3.2 方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度測(cè)定結(jié)果

表3 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for prothioconazole and prothioconazole-desthio in wheat grains, wheat straw and soil (n= 5)

如表3所示，在0.02、0.1 mg/kg和0.5 mg/kg 3 個(gè)添加水平下，丙硫菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中回收率分別為87.3%～103.0%、93.6%～100.3%和85.0%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.5%～8.4%、9.3%～10.1%和8.9%～10.3%；硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中回收率分別為93.2%～109.9%、92.7%～101.9%和81.7%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%～8.4%、4.2%～7.6%和4.0%～8.3%。各樣本的添加回收率和變異系數(shù)在允許范圍內(nèi)，符合NY/T 788—2004的要求?？瞻滋砑拥湫蛨D譜見圖2。

圖2 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的空白與添加回收樣品HPLC-MS/MS圖Fig. 2 HPLC-MS/MS pro fi les of prothioconazole and prothioconazoledesthio in wheat grains, wheat straw and soil

2.4 丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑消解動(dòng)態(tài)結(jié)果

圖3 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥植株（A）及土壤（B）的消解動(dòng)態(tài)曲線Fig. 3 Dynamic curves of prothioconazole and prothioconazole-desthio residue in wheat straw (A) and soil (B)

江蘇、河南和北京三地中丙硫菌唑在植株的原始沉積量分別為0.182、0.148 mg/kg和0.142 mg/kg，在土壤中的原始沉積量分別為0.086、0.025 mg/kg和0.044 mg/kg，其殘留量與施藥后間隔時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系，降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線。如圖3所示，植株消解動(dòng)力學(xué)方程：江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.184 7e-0.159t，R2=0.999 0，半衰期t1/2=4.4 d；河南試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.123 7e-0.395t，R2=0.824 2，半衰期t1/2=1.8 d；北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.202 6e-0.211t，R2=0.872 6，半衰期t1/2=3.3 d。河南土壤中殘留量的檢出值少于3 個(gè)，未作回歸曲線；江蘇和北京土壤中消解動(dòng)力學(xué)方程：江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.044 7e-0.037t，R2=0.555 1，半衰期t1/2=18.7 d；北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.079 8e-0.050t，R2=0.740 1，半衰期t1/2=13.9 d。

江蘇、河南和北京三地中硫酮菌唑在植株的原始沉積量分別為0.599、0.361 mg/kg和0.566 mg/kg，在土壤中的原始沉積量分別為0.041、0.014 mg/kg和0.013 mg/kg，植株中殘留量與施藥后間隔時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系，降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線。如圖3B2所示，土壤中殘留量與施藥后間隔時(shí)間不呈指數(shù)關(guān)系，這可能與土壤環(huán)境更復(fù)雜有關(guān)，未作回歸曲線。植株消解動(dòng)力學(xué)方程：江蘇試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.438 6e-0.111t，R2=0.709 2，半衰期t1/2=6.2 d；河南試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.484 4e-0.236t，R2=0.934 2，半衰期t1/2=2.9 d；北京試驗(yàn)點(diǎn)為Ct=0.365 1e-0.115t，R2=0.738 1，半衰期t1/2=6.0 d。

2.5 丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑最終殘留測(cè)定結(jié)果

如表4所示，小麥?zhǔn)斋@時(shí)采收，在一年三地小麥籽粒樣品中均未檢出丙硫菌唑和硫酮菌唑的殘留，丙硫菌唑在小麥植株中殘留量為＜0.02～0.225 mg/kg，在土壤中殘留量為＜0.02～0.033 mg/kg；硫酮菌唑在小麥植株中殘留量為＜0.02～0.282 mg/kg，在土壤中殘留量為＜0.02～0.049 mg/kg。

表4 丙硫菌唑及硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株及土壤中的殘留量Table 4 Residues of prothioconazole and prothioconazole-desthio in wheat grains, wheat straw and soil

3 討 論

本研究采用QuEChERS前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，定性、定量研究丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑在小麥籽粒、小麥植株和土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)河南地區(qū)丙硫菌唑與硫酮菌唑的半衰期低于江蘇和北京兩地，江蘇和北京這兩地在2016年平均日照時(shí)間約為250 h，而河南地區(qū)2016年的平均日照時(shí)間在350 h以上，這可能是隨著日照時(shí)間的延長(zhǎng)從而加速了丙硫菌唑與硫酮菌唑的降解。植株動(dòng)態(tài)樣品中丙硫菌唑的原始沉積量均小于硫酮菌唑的原始沉積量，丙硫菌唑的半衰期比硫酮菌唑半衰期短。相同間隔期的終殘樣品中丙硫菌唑檢出值均小于硫酮菌唑的檢出值，說明在自然環(huán)境中丙硫菌唑很快轉(zhuǎn)化為硫酮菌唑。GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[30]中丙硫菌唑的殘留定義為丙硫菌唑脫硫代謝物（硫酮菌唑），以丙硫菌唑計(jì)，小麥中的臨時(shí)限量標(biāo)準(zhǔn)為0.1 mg/kg；食品法典委員會(huì)中丙硫菌唑的殘留定義為硫酮菌唑。現(xiàn)有定義中均未涉及丙硫菌唑的殘留，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究丙硫菌唑和硫酮菌唑的消解趨勢(shì)，結(jié)果表明，丙硫菌唑很快轉(zhuǎn)化為硫酮菌唑，硫酮菌唑殘效期長(zhǎng)于丙硫菌唑殘效期。在三地的小麥籽粒中丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑均未檢出，但植株中硫酮菌唑檢出值均高于丙硫菌唑，因此，與丙硫菌唑相比，硫酮菌唑在小麥中的殘留量更需引起人們的關(guān)注。

4 結(jié) 論

丙硫菌唑在小麥植株和土壤中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型，硫酮菌唑在小麥植株中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型，土壤中降解動(dòng)態(tài)不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型。丙硫菌唑在小麥植株中半衰期為1.8～4.4 d，土壤中的半衰期分別為13.9～18.7 d；硫酮菌唑在小麥植株中半衰期為2.9～6.2 d。40%丙硫·戊唑醇懸浮劑以300 g a.i./hm2推薦劑量及450 g a.i./hm2劑量施藥時(shí)，丙硫菌唑及其代謝物硫酮菌唑在小麥籽粒中均未檢出。表明在推薦使用劑量條件下，在小麥上施用丙硫菌唑是安全的。