CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的IL-6基因敲除對結(jié)腸癌SW1116細胞化療敏感性的影響

馬 燕，葉子瑜，梁艷芳，王 斌，陳莎莎， 顏慧敏，林碧華，周克元，梁 統(tǒng)，曾今誠△

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)/廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)/東莞市醫(yī)學(xué)活性分子開發(fā)與轉(zhuǎn)化重點實驗室，廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第五人民醫(yī)院病理科 523900)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢。雖然早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)治療可使很多患者得到根治，但25%的病例在初診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，且約50%的患者最終發(fā)展成為不能切除的轉(zhuǎn)移病例[1]。對于晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者，化療是其主要的治療手段。然而，化療后中位腫瘤進展時間(TTP)仍舊很短(6～8個月)，提示結(jié)腸癌存在著內(nèi)在耐藥性或獲得性耐藥[2]。結(jié)腸癌耐藥是影響化療效果和患者預(yù)后的重要原因之一，因此，研究結(jié)腸癌耐藥的發(fā)生及其機制是化療增敏或逆轉(zhuǎn)耐藥的基礎(chǔ)。白細胞介素6(IL-6)是一種多細胞來源并具有復(fù)雜生物學(xué)功能的單鏈糖蛋白細胞因子，相對分子質(zhì)量為26×103[3]。IL-6可參與炎癥反應(yīng)和急性時相反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種細胞增殖分化，促進造血，并在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4]。IL-6 及其受體的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，包括乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、頭頸癌[7]、肝癌[8]等。有研究報道，IL-6與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，血漿高水平的IL-6往往提示預(yù)后不良[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可能介導(dǎo)了乳腺癌的順鉑(CDDP)耐藥[5]，靶向調(diào)節(jié)IL-6極有可能成為逆轉(zhuǎn)某些腫瘤耐藥的新靶點。目前，有關(guān)IL-6介導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥的機制研究報道不多。本研究采用短回文重復(fù)序列/核酸內(nèi)切酶9(CRISPR/Cas9)技術(shù)構(gòu)建IL-6基因敲除的結(jié)腸癌SW1116細胞系并評價其生物學(xué)活性及探討其對化療藥物CDDP的敏感性，為IL-6介導(dǎo)的結(jié)腸癌化療耐藥機制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與細胞株 phU6-sgRNA骨架質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，E.coli DH5ɑ感受態(tài)購自天根生化科技有限公司，SW1116細胞株由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 Oligo引物購自上海捷瑞生物工程有限公司；Prestained Protein Ladder、限制性內(nèi)切酶BsaBⅠ購自Thermo公司；jetPRIME?試劑購自Polyolus公司；T4 DNA Ligase購自Fermentas公司；Trytone、Yeast Extract和Agar Powder購自O(shè)XOID公司；2×Taq Plus Master Mix購自Vazyme公司；Agarose購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；碘化丙啶(PI)、BCA蛋白定量試劑盒和CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；APC Annexin V 凋亡檢測試劑盒(APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI)購自BioLegend公司；IL-6、Cyclin E、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗體購自CST公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP表達質(zhì)粒構(gòu)建 利用CRISPR網(wǎng)絡(luò)工具(http://crispr.mit.edu)在人IL-6基因的合適位點選擇sgRNA的靶向序列，設(shè)計3個不同的sgRNA，即IL-6 sgRNA1-3。寡核苷酸序列如下，sgRNA1上游引物：5′-ACC GCA CTA CTC TCA AAT CTG TTC-3′，下游引物：5′-AAA CGA ACA GAT TTG AGA GTA GTG-3′；sgRNA2上游引物：5′-ACC GTT TGT CAA TTC GTT CTG AAG-3′，下游引物：5′-AAA CCT TCA GAA CGA ATT GAC AAA-3′，sgRNA3上游引物：5′-ACC GGA ACA GAT TTG AGA GTA GTG-3′，下游引物：5′-AAA CCA CTA CTC TCA AAT CTG TTC-3′。在每條sgRNA序列正義鏈的5′端添加ACCG，反義鏈的5′端添加AAAC，與經(jīng)Bsa Ⅰ酶切后的phU6-sgRNA backbone表達質(zhì)粒載體形成的黏性末端互補，構(gòu)建Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP表達質(zhì)粒。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將SW1116細胞接種至6孔板中進行培養(yǎng)，待細胞密度為70%～80%時，使用轉(zhuǎn)染試劑jet PRIME?進行細胞轉(zhuǎn)染(質(zhì)粒終濃度為1 μg/mL)，以等量空白載體為陰性對照。

1.2.3基因組DNA提取 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用細胞基因組提取試劑盒對各組SW1116細胞按照說明書操作步驟提取細胞基因組。

1.2.4錯配酶法(Surveyor)篩選高活性sgRNA 使用QI Aquick PCR purification Kit試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，將回收的產(chǎn)物稀釋至20 mg/L，按照Surveyor分析試劑盒說明書步驟進行檢測，2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.2.5IL-6基因敲除SW1116細胞株篩選 為了進一步獲得穩(wěn)定敲除IL-6的SW1116細胞株，將Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞株48 h后，采用有限稀釋法將細胞接種至96孔板(保證單細胞接種)。待細胞擴增至6孔板時，取部分細胞進行傳代及保種，剩余細胞提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測IL-6表達。

1.2.6Western blot法檢測蛋白質(zhì)表達 RIPA裂解液和1%的蛋白酶抑制劑混合液提取細胞總蛋白質(zhì)，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質(zhì)上樣質(zhì)量為50 μg，電泳完成后，依次進行PVDF膜轉(zhuǎn)膜、50 g/L牛奶封閉、洗膜(1×TBST,5 min,3次)、孵育一抗(4 ℃過夜)、洗膜、孵育二抗(室溫1 h)、洗膜(1×TBST,5 min,3次)，化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)印記條帶。

1.2.7CCK-8法檢測細胞增殖 消化處理對數(shù)期SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞，約3 000個/孔接種至96孔板，分別于24、48、72 h更換新鮮培養(yǎng)基，吸取10 μL CCK-8溶液于待測孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)為450 nm，檢測各孔光密度值(OD450)。

1.2.8PI染色檢測細胞周期 培養(yǎng)SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞48 h，胰酶消化后離心，PBS清洗2次，1 mL 4 ℃ 75%乙醇重懸，固定12 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，200 μL PBS 重懸細胞，加入150 μL Rnase，37 ℃孵育40 min后加入200 μL PI溶液，4 ℃孵育2 h，流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期。

1.2.9APC Annexin V-PI檢測細胞凋亡 培養(yǎng)SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞48 h，胰酶消化細胞后離心，PBS清洗2次，加入195 μL Binding buffer重懸細胞。加入5 μL APC Annexin V混勻，再加入10 μL PI溶液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，F(xiàn)CM檢測細胞凋亡。

1.2.10藥物敏感性試驗 消化處理對數(shù)期SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞，將1×104個/孔細胞接種至96孔板，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，加入終濃度為5 mmol/mL的CDDP，置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h更換新鮮培養(yǎng)基，吸取10 μL CCK-8溶液于待測孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，檢測各孔OD450。

2 結(jié) 果

2.1IL-6基因敲除SW1116細胞株的建立與鑒定 根據(jù)IL-6基因序列，合成3個sgRNA寡核苷酸序列(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)，將合成的序列分別與Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒(圖1A)進行重組，分別得到Lenti-Cas9- IL-6-sgRNA-1-EGFP質(zhì)粒、Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-2-EGFP質(zhì)粒和Lenti-Cas9- IL-6-sgRNA-3-EGFP質(zhì)粒。采用QI Aquick PCR purification Kit試劑盒進行PCR產(chǎn)物純化，將回收產(chǎn)物通過T7E1酶切后2 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示針對IL-6-sgRNA-1有較好的打靶效率(圖1B)。采用有限稀釋法將Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞經(jīng)過克隆化培養(yǎng)，篩選得到4株單克隆細胞株，分別命名C1、C2、C3、C4，提取細胞蛋白進行Western blot檢測單克隆細胞IL-6表達量(圖1C)，結(jié)果顯示與對照組(NC)相比，C2～4細胞株表達少量IL-6，命名為IL-6-/+SW1116細胞株，C1細胞株完全不表達IL-6，將其命名為IL-6-/-SW1116細胞株。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞48 h后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)與對照組(NC)相比，轉(zhuǎn)染了Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP質(zhì)粒的SW1116細胞多表達綠色熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞株成功(圖1D)。

A：質(zhì)粒Leti-Cas9-IL-6-sgRNA-EGFP結(jié)構(gòu)示意圖;B：Surveyor法檢測sgRNA活性；C：Western blot檢測IL-6表達；D：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW1116細胞(熒光下視野,×10)

2.2IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞增殖、周期和凋亡檢測結(jié)果 與對照組SW1116細胞比較，IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞增殖無明顯差別(圖2A)；鏡下觀察三種細胞狀態(tài)基本一致，生長良好(圖2B)。細胞周期檢測結(jié)果顯示，SW1116細胞、IL-6-/-SW1116和IL-6-/+SW1116細胞各期(G1、S、G2期)細胞數(shù)量均無明顯差異(圖2C)；細胞凋亡結(jié)果顯示IL-6基因敲除后，SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116細胞的凋亡率均無明顯差異(圖2D)。Western blot結(jié)果顯示細胞周期蛋白質(zhì)Cyclin E在SW1116、IL-6-/+SW1116、IL-6-/-SW1116三種細胞中的表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 Western blot檢測Cyclin E表達及定量分析

A：顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)(×200)；B：FCM檢測細胞凋亡；C：CCK-8法檢測細胞增殖；D：Western blot檢測Bax及Bcl-2等表達;E：Bax及Bcl-2等表達定量分析；a:P<0.05，b：P<0.01，與SW1116比較；c：P<0.01,與IL-6-/- SW1116比較

2.3CDDP干預(yù)對IL-6-/-SW1116細胞增殖及細胞內(nèi)Bax等表達的影響 與SW1116細胞相比，終濃度為5 mmol/mL CDDP 作用IL-6-/+SW1116和 IL-6-/-SW1116細胞72 h后，IL-6-/-SW1116細胞生長狀態(tài)明顯變差(圖4A)，細胞凋亡率增加(圖4B)，細胞增殖受到明顯抑制(圖4C)。Western blot結(jié)果顯示IL-6-/-SW1116細胞胞內(nèi)Bax表達顯著增高，Bcl-2、p-STAT3和STAT3表達顯著降低，見圖4D、E。

3 討 論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新近發(fā)展起來的、廣泛應(yīng)用于細菌、酵母、動物和植物中的基因組定點編輯技術(shù)，具有精確的靶向功能。本研究采用Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP骨架質(zhì)粒構(gòu)建得到Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-1-EGFP、Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-2-EGFP和Lenti-Cas9-IL-6-sgRNA-3-EGFP重組質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW1116細胞，經(jīng)篩選鑒定得到一株IL-6基因全敲除和IL-6基因部分敲除的結(jié)腸癌細胞系：IL-6-/+SW1116和IL-6-/-SW1116細胞。該兩種細胞除IL-6表達受到影響外，其細胞生長狀況、細胞增殖能力及細胞周期變化均于野生型SW1116無明顯差異(P>0.05)，提示IL-6基因敲除可能并不影響結(jié)腸癌細胞生長增殖。值得注意的是，當(dāng)采用終濃度為5 mmol/mL CDDP分別干預(yù)野生型SW1116、IL-6-/+SW1116和IL-6-/-SW1116細胞72 h后，IL-6-/-SW1116細胞生長狀態(tài)明顯變差，細胞增殖能力受到明顯抑制，提示IL-6-/-SW1116細胞對CDDP敏感性增加。Western blot檢測顯示CDDP干預(yù)后，IL-6-/-SW1116細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減低。

IL-6是一種多功能、多效性細胞因子，主要由位于腫瘤微環(huán)境內(nèi)的多種細胞類型產(chǎn)生，包括腫瘤浸潤免疫細胞、基質(zhì)細胞和腫瘤細胞本身[10-11]。IL-6/JAK/STAT3途徑在多種實體腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和頭頸癌等)中過度活化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。在腫瘤微環(huán)境中，IL-6/JAK/STAT3信號通路驅(qū)動腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，且強烈抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[12]。IL-6直接作用于腫瘤細胞以誘導(dǎo)STAT3靶基因的表達，促進腫瘤增殖相關(guān)蛋白質(zhì)(如Cyclin D1，Cyclin E)、血管生成因子(如血管內(nèi)皮生長因子)、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(如基質(zhì)金屬蛋白酶)和免疫抑制因子(如IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β)表達[12-14]。STAT3也可促進IL-6基因表達，從而形成自分泌反饋環(huán)[14]。STAT3還促進對常規(guī)化療和放療及靶向治療(如西妥昔單抗)的耐藥性[15]。有研究顯示通過正反饋回路激活STAT3可能是藥物處理的癌細胞耐藥的主要機制，結(jié)果顯示外周血高水平IL-6與結(jié)腸癌患者腫瘤大小、分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[14,16]。作者所在課題組亦發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織高表達IL-6，且與腫瘤大小、分化程度、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等密切相關(guān)(結(jié)果待報道)。

為了進一步探討腫瘤源性IL-6在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及耐藥中的作用，本研究建立了穩(wěn)定的IL-6基因敲除結(jié)腸癌細胞系，結(jié)果顯示IL-6基因敲除結(jié)腸癌細胞系對化療藥物CPPD敏感性增加，且該過程可能與STAT3信號通路受到抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了對CDDP敏感，且細胞生長、增殖、周期穩(wěn)定的IL-6基因敲除結(jié)腸癌SW1116細胞系，可為深入探索IL-6介導(dǎo)的結(jié)腸癌化療耐藥機制提供一定實驗基礎(chǔ)。