腎腦復(fù)元湯對(duì)阿爾茲海默病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)保護(hù)作用及對(duì)堿性成纖維生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

盛 望 王瑾茜 李旭華 胡國(guó)恒

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410007； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙，410007)

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)以漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知障礙為特征，是多種疾病病因引起的神經(jīng)變性疾病。主要發(fā)生在老年人，俗稱老年癡呆。其機(jī)制與大腦局部，尤其是海馬區(qū)形成神經(jīng)細(xì)胞外以β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心形成的老年斑有關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上選藥組方而成的腎腦復(fù)元湯是治療腦疾病方面的有效方藥[1]?；诖耍狙芯坎捎肁β25-35注入大鼠側(cè)腦室制備AD大鼠模型，旨在為補(bǔ)腎經(jīng)方-腎腦復(fù)元湯治療阿爾茨海默病，重建神經(jīng)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而揭示從腎治腦法對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)制，為臨床防治阿爾茨海默病提供新的治療靶點(diǎn)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取健康雄性清潔級(jí)SD大鼠120只，體重(250±50)g(湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。許可證號(hào)SYXK(湘)2015-0001。自由進(jìn)食、飲水，溫度24～25 ℃，濕度22%，同等條件下分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物 腎腦復(fù)元湯：熟地黃10 g、山茱萸10 g、黃芪30 g、山藥15 g、紅景天20 g、川芎10 g、丹參10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、地龍10 g、當(dāng)歸尾10 g(均購(gòu)于湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。

1.1.3 試劑與儀器 腦立體定向儀(TeoLinc，型號(hào)：MD2000)石蠟切片機(jī)(Leica，型號(hào)：RM2255)臺(tái)式離心機(jī)(Thermo Fisher，型號(hào)：7900HT)Aβ25-35(Sigma，貨號(hào)：#12941)兔抗bFGF試劑盒(Abcam,貨號(hào)：ab106959)兔抗BDNF試劑盒(Abcam,貨號(hào)：ab108319)試劑盒：TUNEL試劑盒(Abcam,貨號(hào)：ab66108)0.2%溴酚藍(lán)(Amresco，貨號(hào)：0449-100G)β-actin抗體(碧云填生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：H015)

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 除空白組(30只)外，造模成功后將動(dòng)物隨機(jī)分為模型組(30只)、腎腦復(fù)元湯組(30只)、對(duì)照組(30只)3組。以上4組按處死時(shí)間分為造模后1周(7 d)、2周(14 d)、3周(21 d)3個(gè)時(shí)相，每個(gè)組每個(gè)時(shí)相保證造模成功10只動(dòng)物。采用立體定向儀下將Aβ25-35注入大鼠側(cè)腦室制備AD模型。將Aβ25-35溶于無(wú)菌生理鹽(4 g/L)，用前37 ℃孵育1周以上。腹腔注射水合氯醛0.35 g/kg麻醉動(dòng)物。將大鼠固定于立體定位儀上，選雙側(cè)海馬齒狀回背側(cè)細(xì)胞帶為注射區(qū)。定位坐標(biāo)為前囟后3.0 mm，左側(cè)旁開(kāi)2.0 mm，硬腦膜下2.9 mm，門齒鉤平面低于耳間線平面2.4 mm。β-淀粉樣蛋白組以10 μL微量注射器注射β-淀粉樣蛋白溶液3 μL(控制注射速度為0.3 μL/min)，留針5 min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針；假手術(shù)組以生理鹽水注射于海馬。

1.2.2 給藥方法 模型組、假手術(shù)組每天灌胃3 mL蒸餾水，中藥組選用腎腦復(fù)元湯，人臨床用量為125 g/d，按11.25 g/kg劑量灌胃;陽(yáng)性對(duì)照藥組選用鹽酸多奈哌齊，人臨床用量為5 mg/d，按0.92 mg/kg劑量灌胃。各組大鼠每天每組均各灌胃1次，直至處死。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法 取出腦組織，使用4%多聚甲醛內(nèi)固定，取雙側(cè)端腦前2/3，切片行HE及TUNEL染色，取雙側(cè)端腦后1/3，放置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)渥鱓estern Blot，以檢測(cè)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic factor，BDNF)蛋白的表達(dá)[2]。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)結(jié)果通過(guò)HE染色后顯示，1周后假手術(shù)組細(xì)胞排列規(guī)整，胞核居中，模型組可見(jiàn)梗死區(qū)細(xì)胞呈病灶性聚集，排列紊亂，病灶周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，水腫，壞死發(fā)生；中藥組細(xì)胞排列較規(guī)整，壞死程度較輕，但仍然有炎性反應(yīng)，水腫；對(duì)照組可見(jiàn)心肌細(xì)胞致密生長(zhǎng)，且炎性反應(yīng)，水腫較為輕。見(jiàn)圖1。

圖1 第7天時(shí)海馬區(qū)細(xì)胞病理染色(HE×)

注：A,B,C,D分別指假手術(shù)組、模型組、中藥組、對(duì)照組

2.2 凋亡細(xì)胞結(jié)果 通過(guò)TUNEL染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞，檢測(cè)后顯示，各組大鼠均有明顯的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)，但隨時(shí)間推移凋亡逐漸減輕；中藥組(第14天)、對(duì)照組(第7、14天)細(xì)胞凋亡較模型組減輕(P<0.05)；對(duì)照組第7天時(shí)凋亡較中藥組減輕(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 第7天時(shí)皮層細(xì)胞(TUNEL染色×400)

注：A,B,C,D分別指假手術(shù)組、模型組、中藥組、對(duì)照組；箭頭示凋亡細(xì)胞

表1 第7天時(shí)各組大鼠海馬區(qū)bFGF,BDNF的蛋白表達(dá)

注：與模型組比較，*P<0.05

圖3 第7天時(shí)各組大鼠海馬區(qū)bFGF,BDNF的蛋白表達(dá)

注：A,B,C,D分別指假手術(shù)組、模型組、中藥組、對(duì)照組

2.3 bFGF,BDNF表達(dá)結(jié)果 大鼠造模后，bFGF，BDNF表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高；與模型組比較，中藥組(第7天)、對(duì)照組(第7天)bFGF，BDNF表達(dá)上升(P<0.05)；中藥組(第14天)bFGF，BDNF表達(dá)較對(duì)照組上升(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖3。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，隨著對(duì)AD研究的深入，有關(guān)AD診斷及治療指南得到不斷修改完善，但迄今其治療仍是難點(diǎn)。目前對(duì)AD的治療除心理社會(huì)干預(yù)及環(huán)境行為改善外，主要藥物治療還是與改善神經(jīng)元突觸的傳遞功能，或者保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免受興奮性氨基酸毒性的破壞等方面有關(guān)，這也僅僅只是暫時(shí)緩解患者認(rèn)知功能的減退過(guò)程[3]。目前藥物治療效果不理想，因此尋找有效的治療方法迫在眉睫。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD屬于“呆證”“健忘”“癡呆”等范疇[4]。《靈樞·海論》曰：“腦為髓之?！薄八韬２蛔悖瑒t腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸，眩冒，目無(wú)所視，懈怠安臥”。由于腦為元神之府，總統(tǒng)諸神，故AD病位主要在腦。而腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其發(fā)病主要以腎虛為本，瘀血為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)[5]。因此，當(dāng)活血化瘀同時(shí)，要考慮補(bǔ)腎生髓，即中醫(yī)“標(biāo)本兼治”。“治標(biāo)”為活血祛瘀，“治本”補(bǔ)腎生髓。根據(jù)“腎腦同治”方論而成的腎腦復(fù)元湯是治療AD的有效方藥，具有益腎生髓、活血通絡(luò)之功效[6]。其組方為：干地黃10 g、黃芪30 g、山藥15 g、山茱萸10 g、紅景天20 g、赤芍10 g、牡丹皮10 g、地龍10 g、當(dāng)歸尾10 g。經(jīng)臨床應(yīng)用證明該方可明顯改善AD患者的神經(jīng)功能，提高臨床療效[7]。

近年來(lái)，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族在阿爾茲海默病中的治療作用及機(jī)制引起廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子能有效保護(hù)基底前腦膽堿能神經(jīng)元受損傷導(dǎo)致的神經(jīng)變性、改善空間記憶，因而有望成為治療AD的有效途徑。堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)同屬神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，在AD病中對(duì)腦組織損傷修復(fù)起著重要的作用。是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員[8]，有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF的表達(dá)水平呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。BDNF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化及可塑性[9]，并且這種能力是通過(guò)激活高親和力受體TrkB和低親和力受體p75NTR而實(shí)現(xiàn)。研究表明，通過(guò)降低TrkB從而減少BDNF信號(hào)可導(dǎo)致空間記憶受損，而TrkB表達(dá)的適度增加則可以增強(qiáng)記憶。這一系列研究表明，BDNF可能在AD發(fā)病機(jī)制和治療中發(fā)揮潛在作用[10]。bFGF屬于FGF家族，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員[11]。正常情況下，其在腦組織內(nèi)含量較少，但在阿爾茲海默病后bFGF的表達(dá)明顯增加。其可以通過(guò)促血管形成、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、并抑制神經(jīng)元凋亡[12-13]。在生理和病理過(guò)程中起著重要的作用。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的存活，減輕腦損傷引起的認(rèn)知障礙，改善AD模型大鼠基底前腦、皮層和海馬膽堿能神經(jīng)纖維密度，提高學(xué)習(xí)記憶能力[14]。

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，腎腦復(fù)元湯可以明顯改善細(xì)胞壞死，并促進(jìn)腦梗死組織修復(fù)，抑制神經(jīng)元凋亡，從而改善神經(jīng)細(xì)胞的存活率；且觀察到BDNF及bFGF的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，證明BDNF及bFGF參與了AD病神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的過(guò)程。此外在第7天時(shí)，BDNF及bFGF均呈高峰值，第7天后有所下降，證明BDNF及bFGF峰值期應(yīng)在第7天左右。另外，在AD造模后早期(第7天)鹽酸多奈哌齊療效更加顯著，在后期(第14，21天)，二者療效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明對(duì)照組西藥鹽酸多奈哌齊發(fā)揮治療效應(yīng)主要是在早期，而腎腦復(fù)元湯應(yīng)在恢復(fù)期。這與中藥“緩則治本”的原則相應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度初步揭示了腎腦復(fù)元湯可能的作用靶點(diǎn)，其作用機(jī)制可能與通過(guò)改善中老年人的腦內(nèi)環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成分泌，修復(fù)受損腦組織，從而改善神經(jīng)功能有關(guān)。