碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌ERIC-PCR指紋圖譜分型的研究

李 睿，辛力華，張 青，張瓊芳，王 芳，任 然，熊大遷

耐藥菌株的出現(xiàn)給抗感染治療帶來極大困擾，細菌一旦對抗生素產(chǎn)生耐藥性且未經(jīng)及時治療和控制，可導(dǎo)致患者間及患者與醫(yī)務(wù)人員之間出現(xiàn)交叉感染，甚至暴發(fā)流行[1-3]。肺炎克雷伯菌在自然界土壤、水源中分布廣泛，同時亦是人類腸道菌群的重要組成部分。當(dāng)人體免疫力降低時，肺炎克雷伯菌可作為條件致病菌引起肺炎、腸炎、泌尿系統(tǒng)炎癥、敗血癥等多種類型的感染。碳青霉烯類抗生素因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性高、副作用小等優(yōu)勢，被廣泛用于多重耐藥腸桿菌科細菌引起的嚴(yán)重感染，導(dǎo)致了碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌誕生，尤以碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(KPC)最常見[4-5]。由于可供選擇的抗生素范圍有限，其預(yù)防和感染控制難度較大，患者預(yù)后差、病死率高，現(xiàn)已引起了WHO的廣泛關(guān)注[6]。本研究收集了我院臨床分離的31株KPC進行藥敏試驗及耐藥表型、基因型檢測、同源性分析，旨在了解KPC耐藥情況及耐藥基因特點，為臨床抗感染治療及院感防控提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集我院2016年7月—2017年4月臨床標(biāo)本中分離出的31株KPC納入試驗范圍，質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯ATCC700603、肺炎克雷伯ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯ATCCBAA-1706。

1.2實驗儀器與試劑

1.2.1實驗儀器：生物梅里埃VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析儀、BACT/ALERT 3D 60/120血培養(yǎng)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱，生物安全柜，比濁儀、伯樂PCR儀、伯樂電泳儀、北京六一照交儀。

1.2.2實驗試劑：①AST-GN13藥敏卡，包括環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、四環(huán)素、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、美羅培南、亞胺培南、哌拉西林、復(fù)方新諾明16種抗生素。美國Thermo Fisher的細菌基因組提取試劑盒和PCR MIX。②血平板、麥康凱平板、嗜血巧克力平板、普通巧克力平板、血培養(yǎng)瓶均為生物梅里埃公司產(chǎn)品。藥敏紙片英國公司Oxoid公司生產(chǎn)。

1.3細菌鑒定與藥物敏感性試驗 分離鑒定及藥敏試驗按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[7]進行操作，所有菌株經(jīng)法國梅里埃公司全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析儀)進行鑒定。藥敏結(jié)果判定符合美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI-M100-S26)標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.4產(chǎn)碳青霉烯酶表型 按CLSI標(biāo)準(zhǔn)進行Hodge試驗，將配置所得麥?zhǔn)隙?.5的標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌ATCC25922經(jīng)無菌生理鹽水以1∶10比例稀釋后均勻涂于M-H瓊脂平板上，干燥3 min以后，將10 μg/片的厄他培南或美羅培南藥敏紙片貼于平板中央，待測菌株從藥敏紙片邊緣向平板邊緣畫線，長度20～25 mm，操作過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，置于35℃溫箱孵育過夜。產(chǎn)碳青霉烯酶陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：被測菌株畫線與大腸埃希菌抑菌ATCC25922圈交叉處見到大腸埃希菌向藥敏紙片方向生長增強。

1.5細菌DNA模板制備 選擇3～6個新鮮菌落，滴加400 μl雙蒸水后振蕩均勻，沸水浴15 min，冰浴2 min后，離心10 min(轉(zhuǎn)速15 000 r/min)，取上清液為細菌DNA模板，置于4～8℃冰箱保存。

1.6細菌耐藥基因PCR檢測 引物設(shè)計參照文獻[9]。引物由生物工程公司(上海)合成。見表1。PCR反應(yīng)體系共50 μl，包括 25 μl的Taq PCR Master Mix，2 μl的上、下游引物，1 μl的待測菌DNA模板，20 μl的雙蒸水。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，變性94℃ 1 min →退火1 min→72℃ 90s，循環(huán)35個周期 →72℃延伸10min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)含4S Red plus的20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察分析并拍照保存。

表1 引物序列及目的產(chǎn)物長度

1.7PCR產(chǎn)物測序分析 PCR產(chǎn)物提純后送生物工程公司(上海)測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站用BLAST比對，確定基因型。

1.8ERIC-PCR同源性分析 PCR反應(yīng)體系共25 μl，包括 0.4 μl 的5 U/μl Exp Tap，2.5 μl 的10×buffer，2 μl 的2.5 mmol/L dNTP，2μl上、下游引物，2μl待測菌DNA模板， 雙蒸水補足至25 μl。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min，變性94℃ 1 min →55℃ 1 min→72℃ 90 s，循環(huán)35個周期 →72℃延伸10 min。引物序列：R-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC，F(xiàn)-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳45 min(90V)，紫外凝膠成像儀拍照。統(tǒng)一基因型：擴增條帶完全相同；亞型：主條帶相同，副帶相差1或2條；不同基因型：條帶相差2條以上。

2 結(jié)果

2.1菌株分布 31株KPC主要來源于重癥監(jiān)護室，共19株，占61.29%；急診科6株，占19.35%；呼吸內(nèi)科3株，占9.68%；腎內(nèi)科、心內(nèi)科、康復(fù)科各1株，占3.23%。

2.2藥敏試驗結(jié)果 所測KPC菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物100%耐藥，僅部分菌株對四環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲口惡唑表現(xiàn)敏感，敏感率分別為3.23%、9.68%、90.32%、67.74%。見表2。

表2 31株KPC藥敏試驗結(jié)果

2.3改良Hodge試驗結(jié)果 改良Hodge試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)31株KPC中29株均為陽性。

2.4PCR擴增結(jié)果及序列分析 30株肺炎克雷伯菌以KPC引物擴增出目的條帶，經(jīng)測序及NCBI網(wǎng)站BLAST比對證實為blaKPC-2基因型；1株肺炎克雷伯菌以IMP11引物擴增出目的條帶，經(jīng)測序及NCBI網(wǎng)站BLAST比對證實為blaIMP-1基因型。電泳結(jié)果見圖1。

2.5ERIC-PCR結(jié)果 ERIC-PCR擴增條帶2～4條，31株KPC可分為30株A1型(包含KPC-2基因)及1株A2型(包含IMP-1基因)。電泳結(jié)果見圖2。

圖1部分碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

M為Marker DNA2000，1～6為產(chǎn)blaIMP-1的肺炎克雷伯菌

圖2部分碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌ERIC-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

M為Marker DNA2000，1～17為碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌菌株

3 討論

碳青霉烯類抗生素系治療多重耐藥菌感染的臨床常用β-內(nèi)酰胺類抗生素，上世界90年代末碳青霉烯類抗生素進入國內(nèi)市場，使用量迅速增長，但同時也導(dǎo)致了KPC的產(chǎn)生，給臨床疾病的治療帶來更大威脅。目前認(rèn)為KPC產(chǎn)生機制與膜孔蛋白表達質(zhì)/量的缺失合并及產(chǎn)碳青霉烯酶相關(guān)[10-11]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)KPC1～17等16種亞型(KPC-1與KPC-2被證實為相同類型)，其中以KPC-2及KPC-3最為常見[12-13]。本研究中31株肺炎克雷伯菌共有30株(96.77%)經(jīng)測序證實為KPC-2，提示我院目前主要流行KPC-2，與國內(nèi)外報道[14-16]的流行趨勢一致。本研究還發(fā)現(xiàn)KPC菌株主要集中于重癥監(jiān)護室，提示該科室患者為KPC菌株感染高危人群，可能存在耐藥菌株，在一定條件下易導(dǎo)致院內(nèi)傳播，應(yīng)引起臨床重視，重點防控。

改良Hodge試驗結(jié)果是CLSI推薦的KPC基因型碳青霉烯酶篩查方法，本研究檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果具有較高一致性，敏感性高達93.55%，2株KPC-2基因型Hodge試驗呈現(xiàn)出假陰性，其原因可能與被測菌株耐藥基因丟失或低水平表達相關(guān)。黃峰等[17]采用改良Hodge試驗與KPC基因檢測結(jié)果的符合率高達100%，提示改良Hodge試驗具有較高靈敏度，可用于疑似產(chǎn)碳青霉烯酶細菌的表型監(jiān)測。李軻等[18]發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對大多數(shù)抗生素耐藥，僅氨基糖苷類、氟喹諾酮類、黏菌素等抗生素可在體外發(fā)揮抗菌效果。本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，KPC菌株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、美羅培南、亞胺培南、哌拉西林等β-內(nèi)酰胺類藥物均100%耐藥，僅部分菌株對四環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明存在活性，這給臨床治療帶來極大困難，進一步探究發(fā)現(xiàn)這些細菌均源于ICU標(biāo)本，疑有高度同源性。

ERIC-PCR方法操作簡單便捷，可作為實驗室大量菌株初步分型檢測的常用方法，同時本研究結(jié)果還可顯示我院存在克隆菌株流行趨勢。因此，臨床醫(yī)師應(yīng)謹(jǐn)慎合理的選擇抗菌藥物的使用，加強KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的監(jiān)測，防止耐藥性傳播。臨床科室做好醫(yī)院環(huán)境的消毒隔離，強化醫(yī)護人員無菌操作培訓(xùn)教育，提高多重耐藥菌醫(yī)院感染控制的重視，減少醫(yī)院內(nèi)交叉感染，有效防止耐藥菌株進一步蔓延擴散。

綜上所述，產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐藥程度較高，臨床治療較為棘手，感染患者預(yù)后差，應(yīng)采取積極防控措施遏制其流行趨勢。