黃連素對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷和炎癥的改善作用及其機制

池 明，高 玲，吳巍巍，張博儒，王 雷

(1.長春醫(yī)學高等?？茖W校基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫教研室，吉林 長春 130031；2.吉林大學第一醫(yī)院燒傷外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長春 130021)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種遍布全球的常見臨床疾病,其主要特征是肺內(nèi)發(fā)生過度激活的炎癥反應導致機體嚴重的氣體交換功能受損，肺泡-毛細血管屏障破壞和肺部發(fā)生水腫[1-2]。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)作為誘導ALI模型的主要物質(zhì)已被廣泛應用。研究[3]表明：作為革蘭陰性菌外膜上發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)——LPS，能夠激活包括腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6 )在內(nèi)的炎癥調(diào)節(jié)介質(zhì)的信號級聯(lián)反應， 進一步加重肺組織損傷。因此控制過度的炎癥反應是治療ALI的關(guān)鍵。黃連素又稱鹽酸小檗堿，是傳統(tǒng)的抗炎抗菌藥物，可治療腸炎和痢疾[4]。而近年來研究表明黃連素對多種疾病包括糖尿病[5]、阿爾茨海默癥[6]和腫瘤[7]等具有廣泛作用，但其對ALI是否具有保護作用尚未確定。因此，本研究通過構(gòu)建LPS誘導的ALI模型，觀察黃連素對LPS誘導的ALI的保護作用，并探討其保護作用機制，以期為臨床ALI的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 6～8周C57BL/6小鼠40只，購自吉林大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(吉)2018-0001?？笲ax、Bcl-2和GAPDH單克隆抗體購于美國Abcam公司，黃連素及HE染色相關(guān)試劑購自美國Sigma公司，超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium,DHE)試劑、肺組織線粒體分離試劑和線粒體膜電位檢測試劑盒[(5，5，6，6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylben zcmidazolylcarbocyanine iodide,(JC-1)盒)]購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TNF-α和IL-6試劑盒購自于北京華英生物技術(shù)研究。酶標儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 小鼠ALI模型的制備、動物分組和給藥 40只小鼠隨機分為對照組、 LPS組、黃連素+LPS組和黃連素組，每組10只。應用無菌生理鹽水配制LPS。各組小鼠分別在5 %水合氯醛麻醉，之后對照組小鼠給予生理鹽水；LPS組和黃連素+LPS組小鼠將LPS(5 mg·kg-1)滴鼻給予，LPS給藥后將小鼠豎立放置，緩慢旋轉(zhuǎn)約15 min確保滴入的LPS能夠均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)；黃連素+LPS組小鼠在給予LPS前5 天行灌胃預防性給予50 mg·kg-1黃連素，每日1次，之后給予LPS滴鼻6 h；黃連素組小鼠給予50 mg·kg-1黃連素灌胃5 d，每日1次。給予LPS 6 h后，取各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織進行后續(xù)實驗。

1.3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)檢測和肺濕干重檢測 肺組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色。每組取3只小鼠，其右下肺葉采用中性甲醛液固定，石蠟包埋后進行切片，HE染色觀察肺水腫程度和炎癥細胞浸潤，觀察肺組織形態(tài)表現(xiàn)。將右肺上葉組織經(jīng)濾紙吸去組織上的水分后稱質(zhì)量(濕重)，置入60 ℃烘箱中72 h以上烘干至恒重，稱取其質(zhì)量(干重)，計算肺濕干重比值。肺濕干重比值=肺濕重/肺干重。

1.4 各組小鼠BALF 中總蛋白濃度和細胞滲出數(shù)檢測 每組取4只小鼠，5 %水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露胸腔，小心分離氣管。將4 ℃預冷的無菌PBS緩沖液0.8 mL從總支氣管緩慢注入肺組織中，此時可明顯看到肺部膨隆，回抽緩沖液，反復3次。將抽出的BALF收集在EP管中。將收集的BALF行 1 500 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量，計算總蛋白濃度。離心后將BALF采用50 μL 0.9 % 生理鹽水重懸沉淀，采用細胞計數(shù)儀計數(shù)BALF中細胞數(shù)，即為細胞滲出數(shù)。每組檢測4個平行樣。

1.5 各組小鼠BALF上清液中TNF-α和IL-6水平檢測 小鼠支氣管BALF于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min取上清液，采用ELISA法檢測BALF上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6水平，實驗方法按試劑盒說明書完成。每組檢測4個平行樣。

1.6 各組小鼠肺組織中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平檢測 取肺組織冰凍切片，復溫至室溫，PBS洗滌3次，每次5 min，擦干玻片水漬，將含有0.5 μmol·L-1DHE的PBS滴加于玻片上，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡觀察肺組織中熒光強度，以熒光強度代表小鼠肺組織中ROS水平。

1.7 各組小鼠肺組織中線粒體膜電位測定 按照說明書純化和準備肺組織線粒體。將配置好的JC-1染色工作液采用JC-1染色緩沖液(1×)稀釋5倍。純化線粒體樣品與5倍稀釋JC-1染色工作液按1∶9混合均勻，于96孔板內(nèi)每孔加入100 μL，每個標本3個孔。采用熒光酶標儀檢測JC-1單體時激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm；檢測JC-1聚合物時激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm。將得到單體吸光度 (A1) 值與聚合物的吸光度 (A2) 值進行比較。如果A1值升高而A2值降低即代表線粒體膜電位降低，線粒體損傷。

1.8 Western blotting法檢測各組小鼠肺組織中Bax/Bcl-2比值 將小鼠肺組織剪碎、勻漿和裂解，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。采用BIO-RAD法測定蛋白表達水平。取50 μg蛋白行SDS-PAGE 電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出膜后采用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌3次，加入抗Bax抗體(1∶500)和Bcl-2 (1∶1 000)， 4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗滌3次，加入相應過氧化物酶標記的二抗，置于脫色搖床搖1 h，PBST洗滌3次。 以Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相并分析。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，實驗重復3次。Bax和Bcl-2蛋白表達水平=每個樣本條帶灰度值/GAPDH灰度值。計算Bax/Bcl-2比值。Bax/Bcl-2=Bax蛋白表達水平/Bcl-2蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織形態(tài)表現(xiàn) 與對照組比較，LPS組小鼠炎癥細胞浸潤肺間質(zhì)和肺泡空間增加，肺泡壁明顯增厚；與LPS組比較，黃連素組小鼠肺組織病理損害明顯減輕；黃連素組和對照組小鼠肺組織病理形態(tài)無明顯區(qū)別。見圖1(插頁四)。

2.2 各組小鼠肺濕干重比值 與對照組比較，LPS組小鼠肺濕干重比值明顯升高(P<0.01)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠肺濕干重比值降低(P<0.05)；黃連素組小鼠肺濕干重比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠BALF中總蛋白濃度和細胞滲出數(shù) 與對照組比較，LPS組小鼠BALF中總蛋白濃度升高(P<0.05)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠BALF中總蛋白濃度明顯降低(P<0.05)，見圖3。與對照組比較，LPS組小鼠BALF中細胞滲出數(shù)增加(P<0.01)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠BALF中細胞滲出數(shù)降低(P<0.05)，見圖4。

*P<0.01 vs control group; △P<0.05 vs LPS group.

Fig.2 Ratios of wet to dry weights of lung tissue of mice in various groups

*P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs LPS group.

Fig.3 Concentrations of total protein in BALF of mice in various groups

* P<0.01 vs control group; △P<0.05 vs LPS group.

Fig.4 Number of exudation cells in BALF of mice in various groups

2.4 各組小鼠BALF上清液中TNF-α和IL-6水平 與對照組比較，LPS組小鼠BALF上清液中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.01)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠BALF上清液中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.01)；與對照組比較，黃連素組小鼠BALF上清液中TNF-α和IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5和6。

* P<0.01 vs control group;△P<0.01 vs LPS group.

Fig.5 Levels of TNF-α in BALF of mice in various groups

*P<0.01 vs control group; △P<0.01 vs LPS group.

2.5 各組小鼠肺組織中ROS水平和線粒體膜電位 正常情況下細胞中產(chǎn)生低水平ROS，LPS組小鼠肺組織中ROS水平升高；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠肺組織中ROS水平降低(圖7，見插頁四)。與對照組比較，LPS組小鼠肺組織中線粒體膜電位降低(P<0.01)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠肺組織中線粒體膜電位升高(P<0.05)。見圖8。

2.6 各組小鼠肺組織中Bax和Bcl-2蛋白表達水平 與對照組比較，LPS組小鼠肺組織中Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01)；與LPS組比較，黃連素+LPS組小鼠肺組織中Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.01)。見圖9和10。

*P<0.01 vs control group; △P<0.05 vs LPS group.

Fig.8 Mitochondrial membrane potential in lung tissue of mice in various groups

Lane 1：Control group；Lane 2：LPS group; Lane 3：Berberine+LPS group; Lane 4：Berberine group.

圖9 各組小鼠肺組織中Bax和 Bcl-2蛋白表達電泳圖

Fig.9 Electrophoregram of expressions of Bax and Bcl-2 proteins in lung tissue of mice in various groups

3 討 論

ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的危急重癥，發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明，病情發(fā)展迅速，病死率高。LPS是革蘭陰性菌的主要致病成分[7]，是引起ALI并最終導致患者死亡的重要原因之一，LPS刺激下，炎癥細胞迅速浸潤肺組織，引起中性粒細胞和巨噬細胞浸潤等炎癥細胞聚集[8-9]，進而導致相關(guān)炎性細胞激活，釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等一系列炎癥介質(zhì)[10]，造成肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示：LPS可引起明顯的肺組織炎癥、肺泡間隔增厚、間質(zhì)充血、水腫和BALF中炎性細胞增多。因此，控制炎癥是治療ALI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

*P<0.01vscontrol group;△P<0.01vsLPS group.

圖10 各組小鼠肺組織中Bax/Bcl-2比值

Fig.10 Ratio of Bax /Bcl-2 in lung tissue of mice in various groups

黃連素又名小檗堿，是自毛莨科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，黃連素具有抗菌、抗炎和抗病毒等多種藥理作用[11-12]。研究[13]表明：黃連素可以通過激活磷酸腺苷活化的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和轉(zhuǎn)錄因子3(transcription factor 3, ATF-3)抑制LPS誘導巨噬細胞中炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放，降低炎癥反應程度。在大鼠哮喘模型中，黃連素對卵清蛋白誘導的氣道炎癥具有明顯的抑制作用，其機制與抑制NF-κB信號途徑有關(guān)[14]。因此本研究采用黃連素治療ALI具有一定可行性。本研究結(jié)果表明：提前5 d連續(xù)給予黃連素后，小鼠肺組織炎癥反應程度明顯降低，氣道壁增厚，肺水腫的嚴重程度亦降低。同時，黃連素明顯改善了LPS引起B(yǎng)ALF中細胞滲出數(shù)增多和TNF-α及IL-6的水平升高。由此可見，黃連素對LPS誘導的肺損傷和炎癥具有明顯的保護作用。

氧化應激是ALI中炎癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，ROS與多種細胞信號傳導級聯(lián)有關(guān)，是導致呼吸道炎癥的重要介質(zhì)[15-17]。研究[18]表明應用蘆薈苷通過抑制ROS產(chǎn)生可明顯降低LPS誘導的肺損傷程度。研究[19]顯示青蒿琥酯可降低ROS誘導的NOD樣受體家族蛋白(NOD-like receptor protein,NLRP3)炎性小體激活從而改善缺血再灌注介導的肺組織損傷。研究[20]表明：黃連素通過抗氧化功能保護巨細胞病毒引起的螺旋神經(jīng)元的凋亡。在糖尿病神經(jīng)病實驗中，黃連素能降低氧化還原反應失衡，保護線粒體功能，降低高糖誘導的神經(jīng)元損傷[21]。DHE是最常用的檢測細胞中超氧化物陰離子水平的熒光探針，可用來檢測細胞中ROS水平，其發(fā)光強度與ROS水平呈正相關(guān)關(guān)系。黃連素抑制LPS誘導肺損傷和炎癥是否與抑制ROS保護線粒體功能有關(guān)目前尚未明確。本研究結(jié)果表明：在LPS誘導的ALI模型中，ROS被激活，進而引起線粒體損傷和凋亡。黃連素通過降低肺損傷小鼠模型中ROS的產(chǎn)生，改善了線粒體膜電位水平的降低趨勢，降低了Bax/Bcl-2比值，進而抑制了LPS誘導肺損傷組織中的細胞凋亡?？梢婞S連素可能通過降低LPS引起的氧化應激保護LPS誘導的肺損傷及炎癥，其機制與保護線粒體功能和減少線粒體凋亡有關(guān)。

綜上所述，黃連素明顯改善了LPS誘導的肺組織損傷和炎癥的程度，其機制可能與抑制體內(nèi)氧化應激和穩(wěn)定線粒體功能有關(guān)。