NMN在糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化中的作用及其機(jī)制

崔 奇，王曼伊，農(nóng)琳琳，翟曉雅，馮樂(lè)平

(1．桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院食品衛(wèi)生與營(yíng)養(yǎng)教研室，廣西 桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院第一附屬臨床醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育科, 廣西 桂林 541004； 3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣西 桂林 541004)

叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a(Forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a)作為FoxO家族成員之一，通過(guò)調(diào)控下游靶基因，在細(xì)胞凋亡、自噬、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化和細(xì)胞代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-4]。p-FoxO3a能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬作用[5]促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡和自噬，以及抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)基因表達(dá)[6]，從而減緩組織纖維化進(jìn)程。研究顯示:沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator,Sirt1)能夠?qū)е聀-FoxO3a去乙?；险{(diào)p-FoxO3a表達(dá)，進(jìn)而阻止氧化應(yīng)激對(duì)組織細(xì)胞帶來(lái)的損傷；p-FoxO3a也同樣受到蛋白激酶B(AKT)在不同位點(diǎn)的磷酸化調(diào)控，從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抵抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮作用。本文作者采用動(dòng)物模型和高糖濃度培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)對(duì)糖尿病引起的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性-纖維化進(jìn)行研究，通過(guò)煙酰胺單核苷酸(NMN)調(diào)控Sirt1和AKT，間接影響p-FoxO3a和小窩蛋白(caveolin-1,Cav-1)表達(dá)，闡明NMN減緩糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)大鼠腎臟纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 0.56 mmol·L-1DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco公司，美國(guó))，10%胎牛血清(Gemini公司，美國(guó))，胰蛋白酶(工作液濃度0.25%)、青霉素和鏈霉素(終濃度分別為100 U·L-1和100 kg·L-1)(Solarbio公司，中國(guó))，鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(Sigma-Aldrich公司，德國(guó))，煙酰胺和NMN(Sigma 公司，美國(guó)),Sirt1單抗(Abcam公司，英國(guó))，兔抗大鼠( Cav-1)單抗(Santa公司，美國(guó))，抗大鼠AKT單抗(Bioword 公司，美國(guó))，F(xiàn)oxO3a和p-FoxO3a單抗(Abcam公司，英國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔多抗和Cy3標(biāo)記的羊抗兔多抗(LIFE公司，美國(guó))。血糖診斷試劑盒(Omron公司，日本)，GT-1640血糖檢測(cè)儀(ARKRAY有限公司，日本)，Cobas111 全自動(dòng)生化分析儀(Roche公司，美國(guó))，LSM700激光共聚焦掃描顯微鏡(Zeiss公司，德國(guó))，Mini-PROTEAN 3 CELL 165-3301電泳系統(tǒng)和小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組和給藥 SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量 200～250 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠于標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯鼠籠中飼養(yǎng)，室溫(23±1)℃，濕度50%～60%，12 h光/暗光照周期，1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10，采用正常飲食，常規(guī)食物包括：脂肪5%、碳水化合物63%、蛋白質(zhì)23%、總熱值25 kJ·kg-1)和實(shí)驗(yàn)組(n=30，采用高脂肪飲食，高脂肪食物包括：脂肪32%、碳水化合物48%、蛋白質(zhì)20%，總熱值54.3 kJ·kg-1)。2組大鼠均采用滅菌的自來(lái)水作為飲用水。實(shí)驗(yàn)組大鼠平均體質(zhì)量為(300±20)g，注射50 mg·kg-1STZ，以0.01 mmol·L-1冰鎮(zhèn)檸檬酸緩沖液(pH 4.5)溶解，在30 min內(nèi)通過(guò)腹腔注射。對(duì)照組大鼠使用檸檬酸鹽緩沖液注射。隨后從尾靜脈中采集血液樣本，用于葡萄糖水平測(cè)定，當(dāng)空腹血糖水平 持續(xù)達(dá)到16.7 mmol·L-1時(shí)，SD大鼠被認(rèn)為是糖尿病模型大鼠。30只實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠進(jìn)一步隨機(jī)分為糖尿病+NMN組和糖尿病+PBS組(每組15只)；糖尿病+NMN組大鼠靜脈注射N(xiāo)MN(120 mg·kg-1)(NMN應(yīng)用200 μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋)，每隔1 d在頸部和肩部松散組織皮下注射，持續(xù)20 d；糖尿病+PBS組大鼠皮下注射接種200 μL無(wú)菌PBS，每隔1 d在頸部和肩部松散組織皮下注射，持續(xù)20 d，之后斷頭處死大鼠，摘取腎臟進(jìn)行組織切片和蛋白提取，分別用于目的蛋白免疫印跡分析及免疫共聚焦分析。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。細(xì)胞保存于正常濃度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)條件下，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于體外37℃、5% CO2條件下適應(yīng)性培養(yǎng)24 h，之后在高濃度葡萄糖(200 mmol·L-1)氧化應(yīng)激條件下繼續(xù)培養(yǎng)1～6 d，并隔天更換相同條件培養(yǎng)基。高濃度葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞按照給予NMN濃度的不同，隨機(jī)分為0、50、100和200 μmol·L-1NMN組，并設(shè)對(duì)照組(未加入高濃度葡萄糖)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白用于相關(guān)目的蛋白的免疫印跡分析。

1.4 免疫共聚焦法檢測(cè)大鼠腎小球細(xì)胞中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平 4%多聚甲醛固定大鼠腎組織，脫水后石蠟包埋并切片，組織切片經(jīng)脫蠟和乙醇梯度脫水，枸櫞酸微波修復(fù)后，加待檢蛋白一抗：抗 Sirt1(1∶500)、AKT(1∶1 000)、p-FoxO3a(1∶1 000)和Cav-1(1∶400)單抗進(jìn)行孵育，4℃冰箱靜置過(guò)夜，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37℃避光孵育 1 h；采用 PBS洗滌 3 次，DAPI 避光染色5 min ，N-丙基沒(méi)食子酸鹽(N-propyl gallate，NPG)(抗熒光淬滅劑)處理后樹(shù)脂膠封片，共聚焦顯微鏡下檢測(cè)大鼠腎小球細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平。綠色熒光代表腎小球細(xì)胞中AKT和p-FoxO3a表達(dá)，紅色熒光代表腎小球細(xì)胞中Sirt1和Cav-1蛋白表達(dá)，采用 ImageJ 2×軟件計(jì)算10個(gè)視野的平均熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示單位面積蛋白表達(dá)水平。

1.5 Western blotting法檢測(cè)HBZY-1細(xì)胞中Sirt1、AKT、p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平 將1 mL含1×106mL HBZY-1細(xì)胞懸液移至直徑為35 cm的培養(yǎng)皿中，增加葡萄糖濃度至200 mmol·L-1，培養(yǎng)6 d后分別加入NMN，濃度分別為 0、50、100和200 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，收集并裂解細(xì)胞提取蛋白，采用Western blotting法檢測(cè)高濃度葡萄糖條件下HBZY-1細(xì)胞中Sirt1、AKT和p-FoxO3表達(dá)水平。取出培養(yǎng)細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液置于 Eppendorf 離心管中，超聲波粉碎儀裂解蛋白，經(jīng)4℃低溫12 000 g、15 min離心取上清液；蛋白定量后行SDS-PAGE電泳，電壓 120 V，PVDF 半干式轉(zhuǎn)膜(電壓150 V、60 min)，牛血清白蛋白封閉濾膜，加入待檢蛋白一抗[Sirt1(1∶500)、AKT(1∶200)、p-FoxO3a(1∶1 000)和Cav-1(1∶600)]，4℃孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)后孵育1 h，將 PVDF 膜置于凝膠成像系統(tǒng)中獲取相應(yīng)蛋白條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白的IA值/β-actin的IA值。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平 免疫共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：與糖尿病+PBS組比較，糖尿病+NMN組大鼠腎小球體積相對(duì)較小，細(xì)胞排列比較密集，且雜亂無(wú)章。糖尿病+NMN組大鼠腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Sirt1(紅色熒光)表達(dá)水平明顯高于糖尿病+PBS組(P<0.01)，糖尿病+NMN組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中AKT(綠色熒光)表達(dá)水平亦高于糖尿病+PBS組(P<0.01)。見(jiàn)圖1(插頁(yè)二)和2。

*P<0.01 compared with diabetes+PBS group.

Fig.2 Expression levels of Sirt1 and AKT proteins in renal parenchymal cells of rats in two groups

2.2 2組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Sirt1和p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平 與糖尿病+PBS組比較，糖尿病+NMN組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Sirt1(紅色熒光)蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),且大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中p-FoxO3a表達(dá)(綠色熒光)水平亦明顯升高(P<0.01)。免疫共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：腎小管細(xì)胞中p-FoxO3a蛋白表達(dá)(綠色熒光)在腎小管細(xì)胞中的分布多于腎小球細(xì)胞，說(shuō)明腎小管細(xì)胞中p-FoxO3a蛋白表達(dá)多于腎小球細(xì)胞。見(jiàn)圖3(插頁(yè)三)和4。

*P<0.01 compared with diabetes+PBS group.

圖4 2組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Sirt1和p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平

Fig.4 Expression levels of Sirt1 and p-FoxO3a proteins in renal parenchyma cells of rats in two groups

2.3 2組大鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平 免疫共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：與糖尿病+PBS組比較，糖尿病+NMN組大鼠腎小管和腎小球細(xì)胞中p-FoxO3a蛋白(綠色熒光)表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，腎小管和腎小球細(xì)胞中Cav-1蛋白表達(dá)水平亦明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖5(插頁(yè)三)和6。

*P<0.01 compared with diatetes+PBS group.

圖6 2組大鼠腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平

Fig.6 Expression levels of p-FoxO3a and Cav-1 proteins in renal parenchyma cells of rats in two groups

2.4 各組HBZY-1細(xì)胞中SIRT1、AKT和p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示：200 mmol·L-1葡萄糖處理HBZY-1細(xì)胞72 h后，分別加入不同濃度(0、50、100和200 μmol·L-1)NMN處理24 h，與對(duì)照組(未經(jīng)200 mmol·L-1葡萄糖處理)比較，50 μmol·L-1NMN組HBZY-1細(xì)胞中Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，100和200 μmol·L-1NMN組HBZY-1細(xì)胞中Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與對(duì)照組比較，50 μmol·L-1NMN組HBZY-1細(xì)胞中p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但100和200 μmol·L-1NMN組HBZY-1細(xì)胞中p-FoxO3a蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖7和8。

2.5 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的HBZY-1細(xì)胞中AKT和Sirt1蛋白表達(dá)水平 采用正常濃度葡萄糖(5.6 mmol·L-1)和高濃度葡萄糖(200 mmol·L-1)分別處理HBZY-1 細(xì)胞，隨后應(yīng)用NMN分別干預(yù)24 h。在正常葡萄糖濃度或高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，細(xì)胞中AKT與Sirt1蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組(5.6 mmol·L-1葡萄糖+0 μmol·L-1NMN)明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明NMN在調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性AKT與Sirt1過(guò)程中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖9和10。

3 討 論

p-FoxO3a蛋白在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)具有雙重作用，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻，細(xì)胞質(zhì)中大量p-FoxO3a蛋白集聚到細(xì)胞核，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。p-FoxO3a蛋白是AKT分子下游能夠啟動(dòng)自噬基因轉(zhuǎn)錄的主要分子，其過(guò)度表達(dá)能夠啟動(dòng)細(xì)胞自噬，并且能夠促使成纖維細(xì)胞分泌膠原明顯減少，從而改善細(xì)胞炎癥-纖維化過(guò)程[8-9]。有學(xué)者在基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn):Cav-1啟動(dòng)子基因內(nèi)包含了幾個(gè)p-FoxO3a結(jié)合位點(diǎn)，使p-FoxO3a牢固地綁定到Cav-1啟動(dòng)子區(qū)域，p-FoxO3a轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加了Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)。研究[11]顯示:通過(guò)改變AKT通路能夠使p-FoxO3a蛋白激活，進(jìn)而增強(qiáng)成纖維細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)膠原蛋白降解，可以促進(jìn)肺部纖維化形成。而具有去乙?；富钚缘某聊畔⒄{(diào)節(jié)因子Sirt1能夠使p-FoxO3a蛋白發(fā)生去乙?；饔茫⒋偈蛊溥M(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯。然而，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，隨著p-FoxO3a蛋白去乙酰化作用增強(qiáng)，p27kip1、Bim和MnSOD等基因表達(dá)水平升高，從而降低細(xì)胞中的活性氧水平，發(fā)揮抗凋亡作用。激活A(yù)KT軸能夠通過(guò)抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)特發(fā)性肺纖維化的成纖維細(xì)胞維持膠原蛋白形成的病理狀態(tài)[12]，說(shuō)明細(xì)胞凋亡是細(xì)胞纖維化形成的重要因素[6，13-14]。但p-FoxO3a蛋白在DN腎臟纖維化方面的調(diào)控作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明：在機(jī)體處于糖尿病腎臟逐步纖維化過(guò)程中，腎小球和腎小管細(xì)胞中內(nèi)源性Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平均明顯降低。本課題組應(yīng)用NAMPT的代謝產(chǎn)物NMN通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，在改善作為前炎癥因子NAMPT表達(dá)的前提下，試圖提高Sirt1蛋白的表達(dá)和活性，通過(guò)Sirt1-p-FoxO3a和AKT-p-FoxO3a對(duì)DN腎臟纖維化的相關(guān)基因發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明：SD糖尿病大鼠在應(yīng)用一定量NMN后，腎小管和腎小球細(xì)胞中Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平均較未施加NMN的對(duì)照組明顯升高。與此同時(shí)，糖尿病+NMN組大鼠腎細(xì)胞中p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組。體外實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用高濃度葡萄糖(200 mmol·L-1)處理 HBZY-1細(xì)胞后，再應(yīng)用不同濃度NMN處理，細(xì)胞中AKT與Sirt1也均較未施加NMN組增加。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)NMN濃度達(dá)100 μmol·L-1時(shí)，Sirt1與AKT蛋白表達(dá)水平均達(dá)到峰值，且均明顯高于對(duì)照組，在相同高濃度葡萄糖糖濃度培養(yǎng)條件下，當(dāng)NMN濃度進(jìn)一步加大到200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞中Sirt1與AKT蛋白表達(dá)水平均未見(jiàn)明顯升高，說(shuō)明NMN能夠使糖尿病狀態(tài)下大鼠腎小球和腎小管細(xì)胞中Sirt1與AKT蛋白表達(dá)水平升高，即NMN能夠在高濃度葡萄糖氧化應(yīng)激狀態(tài)下使HBZY-1細(xì)胞中Sirt1與AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高。在此過(guò)程中，經(jīng)NMN處理的細(xì)胞中 p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)。共聚焦顯微鏡下顯示：糖尿病大鼠腎小球明顯變小，且腎小球內(nèi)細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，呈明顯的纖維化狀態(tài)，但給予NMN后大鼠腎小球形狀明顯比未施加NMN時(shí)規(guī)整，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列有序，說(shuō)明NMN通過(guò)增加腎臟細(xì)胞表達(dá)Sirt1與AKT蛋白，間接激活了p-FoxO3a和Cav-1蛋白表達(dá)，從而在一定條件下改善了DN腎臟炎性纖維化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了NMN能夠通過(guò)Sirt1-p-FoxO3a和AKT-p-FoxO3a對(duì)DN腎臟纖維化的相關(guān)基因發(fā)揮作用。NMN既是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)前體物質(zhì)，又是Nampt合成的底物。在正常情況下，Nampt是細(xì)胞合成DNA的關(guān)鍵限速酶[15]。然而，在機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nampt能夠作為前炎癥因子激活典型的炎癥通路因子轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)，啟動(dòng)炎癥-纖維化通路[16-17]。離體實(shí)驗(yàn)[18-19]結(jié)果表明：在200 mmol·L-1葡萄糖氧化應(yīng)激條件下，50 μmol·L-1以上NMN即能夠通過(guò)負(fù)反饋抑制內(nèi)源性Nampt表達(dá)，同時(shí)在不影響NAD+形成的基礎(chǔ)上，促進(jìn)Sirt1和AKT蛋白表達(dá)水平升高[18-19]。本研究結(jié)果提示：NMN能夠提高糖尿病大鼠腎小球細(xì)胞中內(nèi)源性Sirt1與AKT的表達(dá)水平，并改善p-FoxO3a蛋白的表達(dá)和磷酸化狀態(tài)，從而通過(guò)Cav-1改善腎臟細(xì)胞的炎癥纖維化狀態(tài)，提示NMN及其類(lèi)似物可能在預(yù)防和治療DN腎小球纖維化中發(fā)揮作用。有研究[20-21]進(jìn)一步證明：在NMN的作用過(guò)程中，Sirt1蛋白能使p-FoxO3a的乙酰基遷移，使p-FoxO3a蛋白發(fā)生去乙?；磻?yīng)，從而上調(diào)p-FoxO3a蛋白與特定靶基因的DNA結(jié)合能力并增加其轉(zhuǎn)錄活性。Sirtuins是一種NAD+依賴(lài)性的去乙?；?，即Sirtuins的去乙酰化反應(yīng)需要氧化性的NAD+參與[22]。內(nèi)源性Sirt1蛋白通過(guò)加強(qiáng)p-FoxO3a蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，允許細(xì)胞具有更多時(shí)間來(lái)修復(fù)損傷的DNA，并消除自由基的危害[23]。本研究結(jié)果顯示：在糖尿病大鼠腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中, p-FoxO3a蛋白能夠同時(shí)受到Sirt1和AKT蛋白的共同調(diào)控，這一結(jié)果提示NMN可能在DN腎小球炎癥纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用。

Lane 1：Control group;Lane 2-5:50, 100， and 200 μmol·L-1NMN groups.

圖7 各組HBZY-1細(xì)胞中Sirt1、AKT和p-FoxO3a蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.7 Electrophoregram of expressions of Sirt1, AKT， and p-FoxO3a proteins in HBZY-1 cells in various groups

A:Sirt1;B:AKT;C:p-FoxO3a.1：Control group;2-5:50,100,and 200 μmol·L-1 groups.*P<0.05, **P<0.01 compared with control group.

A: AKT;B: HBZY-1.1，2:Before NMN treatment;3，4:After NMN treatment;*P<0.01 compared with control group.

圖9 對(duì)照組和高濃度葡萄糖組HBZY-1細(xì)胞中AKT和Sirt1蛋白表達(dá)水平

Fig.9 Expression levels of AKT and Sirt1 proteins in HBZY-1 cells in control group and high concentrations of glucose group

Lane 1,2:High concentration of glucose group;Lane 3,4:Control group.

圖10 各組HBZY-1細(xì)胞中AKT(A)和Sirt1(B)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.10 Electrophoregram of expression levels of AKT(A) and Sirt1(B) prioteins in HBZY-1 cells in various groups