上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性及白藜蘆醇對(duì)其干細(xì)胞樣特性的抑制作用

趙麗艷，宋 揚(yáng)，呂曉艷，賈茗博，朱洪權(quán)

(1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春 130041；2．吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的預(yù)后不良顱內(nèi)腫瘤，腫瘤呈侵襲性生長，治療困難和復(fù)發(fā)率高。盡管近年采取多項(xiàng)積極的綜合性治療措施，但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然很差，特別是惡性膠質(zhì)瘤，確診后患者中位生存期僅為14.6個(gè)月[1]。近年大量研究[2-3]顯示：上皮性腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)可以獲得或呈現(xiàn)干細(xì)胞樣性能，形成具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，而具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)特性的細(xì)胞是腫瘤形成、進(jìn)展、治療抵抗、侵襲和復(fù)發(fā)的根本原因[4]。EMT在腫瘤進(jìn)展中具有雙重病理學(xué)意義：一方面EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物學(xué)基礎(chǔ)；另一方面EMT過程能生成具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞。目前對(duì)EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究比較深入，而對(duì)EMT過程中獲得干細(xì)胞樣特性的研究較少，特別是關(guān)于非上皮性腫瘤細(xì)胞如膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程中獲得干細(xì)胞樣特性的研究尚未見報(bào)道。EMT與干細(xì)胞的關(guān)系已引起研究者[5-6]的高度關(guān)注，因?yàn)檫@可能是CSCs新的來源途徑。本課題組前期研究[7]證明：膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以發(fā)生EMT，但尚不清楚膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程中能否產(chǎn)生具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞。多酚化合物白藜蘆醇(resveratrol, Res)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，然而Res能否抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT過程中產(chǎn)生的干細(xì)胞樣特性目前尚未見相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、N2添加劑、B27添加劑、GlutaMax、肝素、Accutase消化液和胰酶-EDTA消化液為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素和鏈霉素購自美國Sigma公司，重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor, EGF)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor, bFGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)購自美國Peprotech公司，Res購自美國ApexBio公司，抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、抗波形蛋白(Vimentin)、抗Snail、抗Slug、抗Zeb1、抗Bmi1和抗Sox2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，抗Twist1抗體購自中國萬類生物公司，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天公司，蛋白Marker為美國Thermo公司產(chǎn)品，抗β-tubulin抗體購自美國Origene公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)為美國Thermo公司產(chǎn)品，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的培養(yǎng) 人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞采用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，每3～5 d采用胰酶-EDTA消化液消化后按1∶2～1∶3傳代。

1.3 倒置顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn) 為觀察TGF-β1誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT后細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)，取處于對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞接種于6孔板中，每孔3×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞過夜貼壁后，更換含有10×10-6g·L-1TGF-β1和1% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)，并照相記錄。

1.4 Western blotting法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物和誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期U87細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為每皿5×105個(gè)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%匯合時(shí)，換為無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，再加入終濃度分別5×10-6g·L-1、10×10-6g·L-1和20 ×10-6g·L-1TGF-β1，以不加入TGF-β1的細(xì)胞為對(duì)照組。作用48 h后吸棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，離心，根據(jù)沉淀的量加入相應(yīng)體積RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每孔加入30～50 μg蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上，室溫下使用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，而后分別加入含有抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail、Slug、Zeb1、Twist1和β-tubulin的一抗(在TBST配制的5%脫脂奶粉中)，4℃過夜孵育。次日，TBST洗膜3次，加入含有相應(yīng)二抗、采用TBST配制的5%脫脂奶粉孵育1～2 h，再洗膜3次，加入ECL顯色劑，在Sagecreation凝膠成像系統(tǒng)中顯影。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參，目的條帶相對(duì)灰度值=目的條帶灰度值/β-tubulin灰度值，以目的條帶相對(duì)灰度值代表檢測(cè)物蛋白表達(dá)水平。

1.5 膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后分組 確定膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞發(fā)生EMT后，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(U87細(xì)胞不做任何處理)、EMT組(TGF-β1誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生EMT)和Res處理組(EMT組基礎(chǔ)上采用Res處理發(fā)生EMT的細(xì)胞)。

1.6 二代膠質(zhì)球形成數(shù)和形態(tài)表現(xiàn) Neurobasal培養(yǎng)基成分包括：20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF、2 mg·L-1肝素、1×B27添加劑、1×N2添加劑、1×GlutaMAX、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素。按Song等[8]的方法檢查膠質(zhì)球形成數(shù)。將誘導(dǎo)發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞采用Neurobasal培養(yǎng)基重懸，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于超低黏度96孔板，在Neurobasal培養(yǎng)基中加入不同濃度(20和40 μmol·L-1)Res，置于含5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)7 d，每2～3 d換液1次并添加新鮮EGF和bFGF。待懸浮生長的膠質(zhì)球直徑大于40 μm時(shí)離心收集，即為一代膠質(zhì)球。將一代膠質(zhì)球采用Accutase消化液消化分散為單個(gè)細(xì)胞懸液后，接種于超低黏度96孔板，采用無血清Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d補(bǔ)充Neurobasal培養(yǎng)基0.02 mL，7 d后倒置顯微鏡計(jì)數(shù)形成的二代膠質(zhì)球數(shù)并觀察其形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 Western blotting法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平 取二代膠質(zhì)球采用Accutase消化液消化分散為單個(gè)細(xì)胞懸液，加入或不加入終濃度為20和40 μmol·L-1Res作用48 h后棄掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，離心后棄去上清，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。使用的一抗為抗Bmi1和抗Sox2。其他操作同1.4。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較，U87細(xì)胞暴露于各濃度TGF-β1 48 h后，細(xì)胞呈分散狀，拉長，類似成纖維細(xì)胞外觀。見圖1(插頁四)。

2.2 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物和誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平 隨著誘導(dǎo)劑TGF-β1濃度的升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和 Vimentin表達(dá)水平逐漸升高(圖2和表1)，誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Zeb1和Twist1蛋白表達(dá)水平也明顯升高(圖2和表2)。10×10-6g·L-1(10 μg·L-1)TGF-β1即能明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞發(fā)生EMT，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用10×10-6g·L-1TGF-β1作為誘導(dǎo)EMT的濃度。

2.3 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞二代膠質(zhì)球的形成數(shù) EMT組二代膠質(zhì)球的形成數(shù)[(100±6)個(gè)]明顯多于對(duì)照組[(70±5)個(gè)](P<0.01)，膠質(zhì)球的體積較大；Res處理組二代膠質(zhì)球的形成數(shù)[(35±4)個(gè)]明顯少于EMT組[(100±6)個(gè)](P<0.01)，膠質(zhì)球的體積縮小。見圖3(插頁四)。

2.4 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，EMT組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與EMT組比較，Res處理組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見圖4和表3。

Lane 1: Control group; Lane 2: 5×10-6g·L-1TGF-β1 group; Lane 3: 10×10-6g·L-1TGF-β1 group; Lane 4: 20×10-6g·L-1TGF-β1 group.

圖2 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物和誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of mesenchymal markers and EMT-inducing transcription factors in glioma U87 cells

表1 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平

GroupN-cadherinVimentinControl0.99±0.060.98±0.06TGF-β1(×10-6g·L-1) 51.29±0.05*1.20±0.08* 101.47±0.04**1.29±0.06** 201.50±0.05**1.36±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，暴露于不同濃度TGF-β1的EMT組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平明顯升高；誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Zeb1和Twist1蛋白表達(dá)水平也明顯升高；倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞呈分散狀、拉長，類似成纖維細(xì)胞外觀。上述結(jié)果表明：TGF-β1誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞發(fā)生了EMT，這與本課題組之前的研究[7]結(jié)果一致。

表2 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中Snail、Slug、Zeb1和Twist1蛋白表達(dá)水平

GroupSnailSlugZeb1Twist1Control1.00±0.060.99±0.030.99±0.071.00±0.05TGF-β1(×10-6g·L-1) 51.24±0.05**1.37±0.04**1.03±0.061.46±0.05** 101.71±0.07**1.40±0.04**1.14±0.03*1.64±0.05** 201.78±0.05**1.63±0.05**1.37±0.07**1.73±0.04**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Lane 1: Control group; Lane 2: EMT group; Lane 3: Res treatment group (20 μmol·L-1Res); Lane 4: Res treatment group (40 μmol·L-1Res).

圖4 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of stem cell markers Bmi1 and Sox2 in glioma cells in various groups

Mani等[9]最早發(fā)現(xiàn)：經(jīng)歷EMT的永生化人乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)此后相繼在肺癌、結(jié)直腸癌和腎癌等實(shí)體瘤[10-12]中被證實(shí)。然而，經(jīng)歷EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞能否產(chǎn)生干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞目前尚未見報(bào)道。研究[13]表明：干細(xì)胞的重要特性之一是具有自我更新能力。在無血清和懸浮培養(yǎng)條件下CSCs能形成腫瘤球，這是干細(xì)胞的一個(gè)特性。腫瘤球形成分析是檢測(cè)CSCs自我更新能力的重要體外功能性實(shí)驗(yàn)，是確定CSCs的有用技術(shù)，二代腫瘤球形成更能說明干細(xì)胞的自我更新能力[14-15]。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)歷EMT的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞二代膠質(zhì)球形成數(shù)較對(duì)照組明顯增多，膠質(zhì)球的體積也增大，表明經(jīng)歷EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出干細(xì)胞的特征之一，即自我更新能力。而Res處理能明顯減少二代膠質(zhì)球形成數(shù)，膠質(zhì)球的體積也縮小，表明Res可以抑制發(fā)生EMT膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自我更新能力，即抑制干細(xì)胞的一個(gè)重要特征。

表3 各組U87細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平

GroupBmi1Sox2Control1.01±0.051.01±0.03EMT1.26±0.04**1.17±0.03*Res treatment (20 μmol·L-1)0.92±0.04△0.98±0.04△Res treatment (40 μmol·L-1)0.91±0.04△0.87±0.06△

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.01vsEMT group.

Bmi1和Sox2均是干細(xì)胞標(biāo)志物，是維持CSCs干細(xì)胞樣特征的重要因子[16]。研究[17]顯示：Bmi1在維持干細(xì)胞樣特性和自我更新中起重要作用。Song等[18]的研究證明：轉(zhuǎn)錄因子Sox2在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣特性維持中起主導(dǎo)作用，是調(diào)控細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子[19]。本研究結(jié)果顯示：誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤EMT后干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi1和Sox2表達(dá)水平明顯升高，表明誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤EMT能產(chǎn)生具有干細(xì)胞性能的細(xì)胞，而Res處理能抑制Bmi1和Sox2表達(dá)水平，進(jìn)一步證明Res能抑制發(fā)生EMT的膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)的干細(xì)胞樣特性。

目前，關(guān)于單獨(dú)靶向抑制或根除CSCs藥物的研發(fā)很多，但關(guān)于靶向抑制腫瘤細(xì)胞EMT所獲得干細(xì)胞的藥物研究很少。本研究結(jié)果證明：Res能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT呈現(xiàn)的干細(xì)胞樣特性。這一研究結(jié)果提示：抑制EMT具有更深層的意義，這是因?yàn)橐种艵MT一方面能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另一方面能抑制EMT生成的CSCs，而CSCs在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、耐藥和復(fù)發(fā)中起根本作用。因此，靶向抑制EMT已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[20]，具有良好的臨床應(yīng)用前景。