過敏性紫癜患兒25-羥維生素D的表達(dá)及與免疫功能的關(guān)系

鄭榮浩，劉冬蕾，黃 力，朱松柏，貴 琳，吳曉林

(湖北省婦幼保健院兒童腎臟風(fēng)濕免疫科，湖北 武漢 430070)

過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura, HSP)又稱亨-舒綜合征，是兒童時(shí)期最常見的一種以小血管炎為主要病理改變的自身免疫性疾病，常累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多個(gè)系統(tǒng)。如累及腎臟則稱之為紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN)，嚴(yán)重危害兒童健康。HSP發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為HSP患兒存在細(xì)胞免疫及體液免疫功能紊亂，主要以IgA介導(dǎo)的體液免疫異常為主[1]，但具體機(jī)制至今尚未闡明。維生素D是一類脂溶性維生素，25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D, 25-(OH)D]是人體內(nèi)最佳的反映維生素D水平的一種存在形式，近年來研究表明，維生素D的生物學(xué)作用已經(jīng)超出以前所認(rèn)識(shí)的，其可通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能及炎癥反應(yīng)，并在一些自身免疫疾病中起重要的作用[2]。研究表明低水平的維生素D與多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)，且其活性代謝產(chǎn)物與疾病的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[2]。HSP作為一種自身免疫性疾病，而維生素D在其中的表達(dá)情況如何國(guó)內(nèi)外目前甚少報(bào)道，因此本研究檢測(cè)HSP患兒的25-(OH)D表達(dá)情況并分析其與細(xì)胞免疫及體液免疫之間的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象與分組

選擇2016年10月至2018年1月在湖北省婦幼保健院住院的139例HSP患兒作為HSP組，選擇同期在我院門診體檢正常的80例兒童作為健康對(duì)照組。139例HSP組患兒根據(jù)是否合并腎臟受累又分為非紫癜性腎炎組(NHSPN組)108例和紫癜性腎炎組(HSPN組)31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：HSP的診斷參考2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)免疫學(xué)組提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。HSPN的納入標(biāo)準(zhǔn)：首次發(fā)作的HSP患兒，在急性期內(nèi)出現(xiàn)血尿和(或)蛋白尿，并排除乙肝病毒相關(guān)性腎炎及狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎小球腎炎，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟學(xué)組提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往3個(gè)月內(nèi)使用任何形式的維生素D治療或補(bǔ)充者；②既往伴有遺傳、代謝、免疫缺陷性疾病，慢性肝腎和消化道疾病，以及活動(dòng)性佝僂病史。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1標(biāo)本采集

所有HSP組患兒均在使用激素、免疫抑制劑和維生素D治療前采集靜脈血6mL，健康對(duì)照組兒童在補(bǔ)充維生素D前空腹采集靜脈血6mL，于8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行外周血25-(OH)D、T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T、CD4+T及CD8+T)、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞，即CD16+CD56+)、B細(xì)胞(CD19+)水平、IgA、IgG、IgM、IgE、C3及C4的水平等檢測(cè)。

1.2.2血清25-(OH)D水平的檢測(cè)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，儀器為島津公司的三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(型號(hào)：島津8050)。具體步驟為：取血清200μL，加內(nèi)標(biāo)溶液(25-羥基維生素D3-氘6和25-羥基維生素D2-氘3)按1∶1比例混合；加10μL甲酸水后常溫下10 000r/min離心5min；取上清液200μL,加正乙烷，再次常溫下10 000r/min離心10min；分層后取上層，氮?dú)獯蹈?；加?fù)溶液100μL，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3免疫指標(biāo)的檢測(cè)

使用美國(guó)BD公司FACSCantoⅡ進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSP患兒的T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及B細(xì)胞水平，試劑購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；采用美國(guó)Beckman公司的Immage800進(jìn)行免疫比濁法檢測(cè)HSP患兒外周血IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及C50的水平，試劑為美國(guó)Beckman公司的配套試劑；具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3倫理審查

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會(huì)審查并批準(zhǔn)，所有入選患兒家屬均簽署知情同意書。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多樣本之間均數(shù)進(jìn)行比較，采用方差分析；兩組間采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采取卡方檢驗(yàn)；使用二元Logistic回歸分析25-(OH)D影響HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險(xiǎn)，并采用多元線性回歸分析血清25-(OH)D與各免疫指標(biāo)的相關(guān)性；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般臨床資料比較

各組兒童年齡、性別、身高、體重、抽血季節(jié)及體質(zhì)量指數(shù)間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 各組兒童一般情況的比較

2.2血清25-(OH)D在各組兒童中的表達(dá)情況

HSP組患兒的血清25-(OH)D水平明顯低于健康對(duì)照組(t=-9.103,P<0.001)，HSPN組患兒血清25-(OH)D水平分別低于NHSPN組和健康對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.857、-8.955,均P<0.05)，見表2。

組別例數(shù)(n)25-(OH)D(ng/mL)健康對(duì)照組8042.318±16.980HSP組13923.262±10.400*NHSPN組10824.657±10.062*HSPN組3118.793±10.109*&

注：*與健康對(duì)照組相比t值分別為-9.103、-8.955、8.955,均P<0.05；&與NHSPN組相比t=2.857,P=0.005。

2.3各組兒童在不同季節(jié)血清25-(OH)D的表達(dá)情況

62例3～9月發(fā)病的HSP組患兒中有13例并發(fā)HSPN，77例9月～次年3月發(fā)病的HSP組患兒中有18例并發(fā)HSPN。3～<9月發(fā)病和9月～次年3月發(fā)病的HSP組患兒血清25-(OH)D水平分別低于同時(shí)間段健康對(duì)照組兒童(t值分別為-8.347、-4.562，均P<0.05)，但9月～次年3月發(fā)病的HSPN組患兒血清25-(OH)D水平與同時(shí)間段NHSPN組患兒的比較無(wú)明顯差異(t=1.336，P=0.186)，見表3。

2.4血清25-(OH)D與HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系分析

血清25-(OH)D影響HSP患病及并發(fā)HSPN的二元Logistic回歸分析顯示，健康對(duì)照組兒童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其發(fā)生HSP的風(fēng)險(xiǎn)將增加至原來的1.103倍(OR=1.103,95%CI:1.073～1.133,P<0.001)，而HSP組患兒25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其發(fā)生腎臟受累的風(fēng)險(xiǎn)降低至原來的0.939倍(OR=0.939,95%CI:0.897～0.983,P=0.007)，見表4和表5。

組別3～<9月9月～次年3月健康對(duì)照組45.326±13.99938.249±19.831HSP組25.491±10.703*21.954±9.580**NHSPN組27.464±9.940*22.755±9.373**HSPN組18.054±10.552*19.327±10.052**

注：*與同時(shí)間段健康對(duì)照組相比t值分別為-8.347、-7.129、-2.997,均P<0.05；**與同時(shí)間段健康對(duì)照組相比t值分別為-4.562、-4.288、4.565,均P<0.05。

表4血清25-(OH)D影響HSP發(fā)病的二元Logistic回歸分析結(jié)果

Table 4 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing the incidence of HSP

表5血清25-(OH)D影響HSP并發(fā)腎臟受累的二元Logistic回歸分析結(jié)果

Table 5 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing HSP with renal involvement

2.5血清25-(OH)D與各免疫指標(biāo)間的相關(guān)性

將HSP組患兒的CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞(CD16+CD56+)、B細(xì)胞(CD19+)、IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及CD4+T/CD8+T比值等各因素與25-(OH)D進(jìn)行多元線性回歸分析，因淋巴細(xì)胞亞群各組的絕對(duì)數(shù)量差異較大，故本研究采用淋巴細(xì)胞亞群之間的相對(duì)百分率來表示其水平，回歸模型采用逐步回歸法，最后進(jìn)入回歸模型的因素有CD8+T和IgA，HSP患兒血清25-(OH)D水平與IgA及CD8+T水平呈負(fù)相關(guān)(β=-0.418，t=-5.538，P<0.001；β=-0.231，t=-3.064，P=0.003)，見表6。

表6 血清25-(OH)D與各免疫指標(biāo)之間的多元線性回歸分析結(jié)果

3討論

3.1 25-(OH)D的水平在HSP患兒中的變化

維生素D是一類脂溶性維生素，經(jīng)紫外線照射皮膚合成和食物攝取的維生素D先經(jīng)過肝臟轉(zhuǎn)化為25-(OH)D，再經(jīng)過腎臟轉(zhuǎn)化為1,25-二羥維生素D[1,25-Hydroxyvitamin D，1,25-(OH)2D]，最后通過作用于細(xì)胞的維生素D受體(Vitamin D receptors,VDR)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。25-(OH)D及1,25-(OH)2D均為維生素D在血液中的存在形式，但因?yàn)?5-(OH)D半衰期長(zhǎng)，在血液中濃度穩(wěn)定，故25-(OH)D是反映體內(nèi)維生素D水平的最佳指標(biāo)。研究表明維生素D的水平在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中明顯降低，且可能在免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]。本研究顯示，HSP患兒血清25-(OH)D水平明顯低于健康對(duì)照組，HSPN組患兒血清25-(OH)D水平低于NHSPN組和健康對(duì)照組，這與郭桂梅等[4]及張遠(yuǎn)達(dá)等[5]研究結(jié)果一致，雖然他們測(cè)定的不是25-(OH)D水平，但都是維生素D的不同代謝產(chǎn)物，這提示維生素D可能參了HSP的發(fā)病過程，并可能與其腎臟受累有一定關(guān)系。

3.2 25-(OH)D與免疫功能的關(guān)系

T細(xì)胞功能改變，B細(xì)胞多克隆活化，體液免疫反應(yīng)總體處于亢進(jìn)狀態(tài)，特別是以IgA介導(dǎo)的體液免疫異常等在HSP發(fā)病中起重要作用[1]。本研究顯示HSP患兒血清25-(OH)D水平與CD8+T及IgA水平呈負(fù)相關(guān)，表明25-(OH)D可能參與了HSP的免疫發(fā)病機(jī)制，與細(xì)胞免疫及體液免疫均有關(guān)。研究表明維生素D除參與鈣磷代謝外，可通過多種途徑調(diào)節(jié)人體的免疫功能。Lysandropoulos等[6]的研究表明1,25-(OH)2D可以下調(diào)CD8+T細(xì)胞水平并抑制其產(chǎn)生細(xì)胞因子γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α，而且VDR基因敲除的老鼠體內(nèi)也顯示升高的CD8+T細(xì)胞水平，這可以解釋本研究HSP患兒的25-(OH)D與CD8+T呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells, Tfh細(xì)胞)是近年來被命名的一類新的CD4+T細(xì)胞亞群，主要負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞激活、增生及分化而影響免疫球蛋白的產(chǎn)生[7]。鄒敏書等[8]的研究顯示HSP患者體內(nèi)存在高表達(dá)的Tfh細(xì)胞，且維生素D可以通過降低Tfh細(xì)胞水平來改善HSP體內(nèi)的免疫反應(yīng)。1,25-(OH)2D也可多方面影響B(tài)細(xì)胞，抑制其增殖、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)化及抗體的生成[2]。本研究顯示HSP患兒血清25-(OH)D水平降低，且與IgA水平呈負(fù)相關(guān)，因此我們推測(cè)患兒體內(nèi)低水平的維生素D也許不能通過降低Tfh細(xì)胞而完全作用于B細(xì)胞來抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，導(dǎo)致HSP體內(nèi)高水平的IgA狀態(tài)，從而進(jìn)一步造成大量IgA沉積于腎臟引起腎臟受累，這也可以解釋本研究HSPN組的25-(OH)D水平更低的原因。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均顯示，維生素D活性的降低與IgE的升高相關(guān)[9]，維生素D也可通過抑制核因子-κB的信號(hào)通路途徑來抑制IgE的抗體類別轉(zhuǎn)換[10]，鑒于哮喘和一些過敏性疾病中也存在維生素D缺乏，因此有學(xué)者認(rèn)為維生素D缺乏與哮喘和一些過敏性疾病的高IgE水平有關(guān)[2]。但本研究未發(fā)現(xiàn)25-(OH)D與IgE之間存在明顯的相關(guān)性，一方面可能是HSP作為一種自身免疫性疾病，過敏因素并不是HSP的主要病因，另一方面可能因?yàn)榫S生素D在不同疾病中對(duì)免疫反應(yīng)的影響不一致有關(guān)。1,25-(OH)2D也可影響輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1,Th1)、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及Th17細(xì)胞等CD4+T細(xì)胞亞群，但目前主要聚集在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的研究中[2]。

3.3 25-(OH)D與HSP患兒發(fā)病及并發(fā)HSPN的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系

本研究顯示25-(OH)D為影響HSP發(fā)病及并發(fā)HSPN的危險(xiǎn)因素，健康兒童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其發(fā)生HSP的風(fēng)險(xiǎn)將增加至原來的1.103倍，而HSP患兒25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其發(fā)生腎臟受累的風(fēng)險(xiǎn)降低至原來的0.939倍。一些臨床研究初步表明，補(bǔ)充維生素D可能降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的復(fù)發(fā)及減少系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者抗雙鏈DNA的陽(yáng)性率[11]，鄒敏書等[8]的研究表明維生素D治療可以改善HSP患兒的免疫功能，因此HSP患兒尤其是并發(fā)腎臟受累者的治療有必要進(jìn)行維生素D的治療或補(bǔ)充。目前，維生素D水平低下的參考值是整個(gè)健康人群維持正常骨骼代謝所需的最小值，然而對(duì)于可以維持免疫調(diào)節(jié)作用的維生素D的水平尚不明確，有研究認(rèn)為對(duì)于風(fēng)濕免疫性疾病應(yīng)給予高于健康兒童維生素D推薦劑量的2～3倍[12]，但具體劑量及療效尚需進(jìn)一步的研究。

總之，維生素D在自身免疫性疾病中的作用已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究表明，維生素D在HSP中水平降低且與細(xì)胞免疫及體液免疫均相關(guān)，因此，維生素D的水平改變及其作用與HSP的關(guān)系具有極其重要的研究?jī)r(jià)值。