干擾維生素D3上調蛋白1通過調控Shh影響高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡*

張明霞， 劉倫志， 向海燕， 譚千林

(湖北民族學院附屬民大醫(yī)院腎內科， 湖北 恩施 445000)

研究顯示糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，而糖尿病腎病作為一種并發(fā)癥，嚴重威脅著人類的生命健康。在中國，糖尿病腎病已經(jīng)成為引起腎衰竭的第二大原因，腎小球損傷和系膜細胞增生等是其主要的病理特點，而腎小球細胞損傷與腎組織功能異常有密切關系[1-3]。糖尿病腎病患者的腎組織中，腎小管上皮細胞大量凋亡，高糖(high glucose，HG)環(huán)境下的腎小管上皮細胞更容易發(fā)生凋亡[4]。維生素D3上調蛋白1(vitamin D3 up-regulated protein 1，VDUP-1)可以調控細胞的分化、增殖和凋亡等過程，是細胞維持內環(huán)境穩(wěn)定的關鍵調控蛋白，其對自然殺傷細胞和氣道上皮細胞等具有重要作用，VDUP-1還參與糖尿病、哮喘、乳腺癌和心絞痛等疾病的發(fā)生[5-8]。近年來的研究顯示，糖尿病腎病腎組織中VDUP-1表達水平異常升高，并且在腎小管細胞中表達，與腎組織氧化損傷有關，可能參與糖尿病腎病發(fā)生，目前對于其在糖尿病腎病腎小管細胞凋亡中的作用及機制尚不清楚[9-10]。音猬因子(Sonic hedgehog, Shh)信號通路調控細胞凋亡，其關鍵調控蛋白Patched 1(Ptch1)、 Smoothened (Smo)、鋅指蛋白Gli2和Shh在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達下降，與腎小管上皮細胞凋亡有關，其參與多種基因調控腎小管上皮細胞凋亡過程[11]。為了明確VDUP-1對高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞凋亡的影響以及其是否通過Shh信號通路發(fā)揮作用，本研究通過體外細胞實驗，運用RNA干擾技術下調VDUP-1的表達，為闡明糖尿病條件下的腎小管上皮細胞凋亡發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人近端腎小管上皮細胞系HK-2購自于武漢細胞庫；重組人Shh蛋白購自ACROBiosystems；VDUP-1 小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)和si-RNA control由山東維真生物公司構建；抗Smo和Shh單克隆抗體購自Abcam；抗Gli2和抗Ptch1單克隆抗體購自Proteintech；抗VDUP-1單克隆抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的IgG購自CTS；ECL發(fā)光試劑盒Thermo；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自索萊寶；caspase-3活性檢測試劑盒和caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司。VDUP-1 siRNA 的正義鏈為GAAACAAAUAUGAGUACAATT-3’，反義鏈為5’-UUGUACUCAUAUUUCUUUCCA-3’。siRNA control的正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGCGAATT-3’。

2 方法

2.1實驗分組 HK-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L葡萄糖)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HK-2細胞分為正常對照(normal)組、HG組、VDUP-1 siRNA組、siRNA control組、Shh組、VDUP-1 siRNA+HG組、Shh+HG組和VDUP-1 siRNA+Shh+HG組，其中：(1)normal組細胞為不做轉染的HK-2細胞，在含有5.5 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(2)HG組細胞為不做轉染的HK-2細胞，在含有40 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(3)VDUP-1 siRNA組細胞為轉染VDUP-1 siRNA的HK-2細胞，在含有5.5 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(4)siRNA control組細胞為轉染siRNA陰性對照的HK-2細胞，在含有5.5 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(5)Shh組細胞為不做轉染的HK-2細胞，在含有5.5 mmol/L葡萄糖和48 μg/L重組Shh的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(6)VDUP-1 siRNA+HG組細胞為轉染VDUP-1 siRNA的HK-2細胞，在含有40 mmol/L葡萄糖的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(7)Shh+HG組細胞為不做轉染的HK-2細胞在含有40 mmol/L葡萄糖和48 μg/L重組Shh的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(8)VDUP-1 siRNA+Shh+HG組細胞為轉染VDUP-1 siRNA的HK-2細胞，在含40 mmol/L葡萄糖和48 μg/L重組Shh的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。HK-2在實驗開始前12 h用不含血清的細胞培養(yǎng)液同步化處理。

2.2Real-time PCR檢測高糖作用后細胞中VDUP-1表達 Normal組和HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液吸除，用冰預冷的生理鹽水洗滌后，加入1 mL的TRIzol，吹打裂解細胞。室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿，旋渦混合15 s，在室溫環(huán)境中放置5 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，上層溶液為RNA水相層，吸取上層溶液，與500 μL的異丙醇混合后，在室溫環(huán)境下靜置10 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，把上清吸除后，在沉淀中加入75%的乙醇溶液，洗滌3次。干燥后，用DEPC水溶解，檢測A260/A280的比值介于1.8～2.0。逆轉錄合成cDNA， real-time PCR測定VDUP-1的mRNA水平，GAPDH為內參照。反應程序為： 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。VDUP-1的上游引物為5’-CCGTTAGGATCCTGGCTTGC-3’，下游引物為5’-GGCGCCTTGTACTCATATTTGTTTC-3’；GAPDH的上游引物為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。

2.3Western blot檢測高糖作用后細胞中VDUP-1的表達 Normal組和HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h。將細胞培養(yǎng)液吸除后，加入提前冰預冷的PBS洗滌2次，加入細胞裂解液，混合后，放在冰上靜置1 h，用細胞刮刀將細胞刮下，繼續(xù)冰浴20 min。將液體轉移到EP管中，在4 ℃、12 000×g離心20 min，把蛋白上清液吸取到另一EP管中。細胞蛋白濃度測定用BCA法，步驟參照BCA蛋白定量試劑盒。把蛋白樣品與上樣緩沖液混合變性后，加入到凝膠樣品孔中后，在濃縮膠中用60 V電泳，在分離膠中用120 V電泳。取出凝膠，放在轉移緩沖液中靜置15 min，把PVDF膜放在甲醇溶液中浸泡10 min。4 ℃，120 mA轉膜60 min，放在5%脫脂奶粉中孵育2 h。與抗VDUP-1 I抗(1∶600)在4 ℃孵育過夜以后，與辣根過氧化物酶標記IgG(1 ∶2 000)在室溫孵育90 min，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，在Odyssey FC顯影，用LabWorks 4.5對蛋白進行定量，以GAPDH為內參照。

2.4細胞轉染 將HK-2細胞以每孔2×105個細胞接種到6孔細胞板中，培養(yǎng)約24 h，細胞融合度約為70%。Solution A：取0.5 μg的VDUP-1 siRNA和siRNA control分別與100 μL的siRNA transfection medium混合；Solution B：轉染前取4 μL的siRNA transfection reagent與100 μL的siRNA transfection medium混合。把Solution A和Solution B混合后，放在室溫條件下孵育30 min，加入到細胞中，放在37 ℃孵育6 h。更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，RT-PCR和Western blot測定抑制效果，步驟同2.2和2.3。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將normal組、HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h。將細胞培養(yǎng)液吸除以后，用0.25%胰蛋白酶消化后，1 000×g離心10 min，收集細胞。加入500 μL的結合緩沖液，混合均勻后，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合后，放在避光條件下孵育20 min，立即用流式細胞儀檢測。

2.6Caspase-3和caspase-9活性的檢測 將normal組、HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h。胰蛋白酶消化后，收集各組細胞，用PBS洗滌2次后，2 000×g離心10 min，吸除上清液，每組收集3×106個細胞，加入60 μL的Lysis Buffer混勻后，放在-20 ℃孵育20 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，BCA法測定蛋白濃度，把蛋白濃度調整為1.8 g/L，吸取50 μL的蛋白上清，加入50 μL的2×reaction buffer(每50 μL的2×reaction buffer中加入0.5 μL的DTT)，混勻后，加入5 μL的caspase-3底物和caspase-9 底物，放在37 ℃孵育4 h，用酶標儀檢測A405，以A405表示caspase-3和caspase-9活性。

2.7TNF-α含量的檢測 將normal組、HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)液上清，用ELISA法測定培養(yǎng)液上清中TNF-α含量，步驟參照試劑盒說明書。

2.8外源性的Shh對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響 將normal組、HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞按照2.1中方法處理以后，培養(yǎng)48 h，Western blot檢測細胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh水平，步驟同2.3。同時用Western blot法檢測normal組和Shh組細胞培養(yǎng)48 h后，監(jiān)測細胞中Ptch1、Smo、Gli2的蛋白水平，步驟同2.3。VDUP-1 siRNA+HG組、Shh+HG組和VDUP-1 siRNA+Shh+HG組的細胞按照2.1中方法處理后，培養(yǎng)48 h，流式細胞術檢測細胞凋亡，試劑盒檢測caspase-3和caspase-9活性，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α水平，步驟同2.5、2.6和2.7?？筆tch1的 I 抗以1 ∶600稀釋,抗Smo的I抗以1∶800稀釋,抗Gli2的I抗以1∶500稀釋,抗Shh的I抗以1∶800稀釋。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高糖作用后細胞中VDUP-1的表達

與normal組比較，HG組的細胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，說明高糖作用后的腎小管上皮細胞中的VDUP-1水平升高，見圖1。

Figure 1. Up-regulation of VDUP-1 expression at mRNA (A) and protein (B) levels in the renal tubular epithelial cells induced by high glucose (HG). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group.

2 轉染后細胞中VDUP-1水平的變化

VDUP-1 siRNA組細胞中VDUP-1 的mRNA和蛋白水平均明顯低于normal組(P<0.05)；而siRNA control組細胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平與normal組相比差異沒有統(tǒng)計學顯著性，說明VDUP-1 siRNA可以下調腎小管上皮細胞中的VDUP-1水平，見圖2。

Figure 2. The expression of VDUP-1 at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group.

3 VDUP-1表達下調對高糖誘導的細胞凋亡及TNF-α分泌的影響

與normal組相比，HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞凋亡率、caspase-3和caspase-9活性及TNF-α含量均明顯升高(P<0.05)；與HG組相比，VDUP-1 siRNA+HG組的細胞凋亡率、caspase-3和caspase-9活性及TNF-α含量明顯降低(P<0.05),見圖3。這表明VDUP-1表達下調抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，并抑制細胞分泌TNF-α。

4 VDUP-1表達下調對高糖環(huán)境下細胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh蛋白表達的影響

與normal組相比，HG組和VDUP-1 siRNA+HG組的細胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平均明顯降低(P<0.05)；與HG組相比，VDUP-1 siRNA+HG組的細胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖4。這表明高糖抑制腎小管上皮細胞中Shh信號通路激活，而VDUP-1表達下調可以部分減弱高糖的這一作用。

Figure 3.The effects of down-regulation of VDUP-1 expression on the apoptosis and TNF-α release of the HK-2 cells induced by high glucose (HG). A: the apoptosis of the cells detected by flow cytometry; B: the changes of the caspase-3 and caspase-9 activities; C: the content of TNF-α in the cell culture supernatant. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group; & P<0.05 vs HG group.

Figure 4.The effects of VDUP-1 down-regulation on the protein levels of Ptch1, Smo, Gli2 and Shh in the HK-2 cells cultured in high glucose (HG) environment. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs normal group; & P<0.05 vs HG group.

5 外源性Shh對細胞中Shh信號通路影響

與normal組比較，Shh組細胞中Ptch1、Smo和Gli2的蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，見圖5。這表明外源性Shh可以促進腎小管上皮細胞中Shh信號通路的激活。

6 外源性Shh對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡及分泌TNF-α影響

VDUP-1 siRNA+Shh+HG組的細胞凋亡率、caspase-3和caspase-9活性及TNF-α含量均明顯低于VDUP-1 siRNA+HG組和Shh+HG組(P<0.05),見圖6。這表明外源性Shh與VDUP-1表達下調具有協(xié)同作用，都能夠抑制高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞凋亡，抑制細胞分泌TNF-α。

討 論

糖尿病腎病以腎小球病變和腎小管間質病變?yōu)橹饕±硖卣?，腎小管間質病變占據(jù)了腎臟面積的90%，腎小管上皮細胞凋亡是腎小球病變的主要原因之一[12-15]。VDUP-1最初被發(fā)現(xiàn)于HL-60白血病細胞中，其cDNA約為2.9 kb，編碼的蛋白質大小為56 kD；該蛋白含有2個PxxP抑制結構域和2個PPxY序列，屬于α-抑制蛋白家族成員，能夠調控蛋白與蛋白之間的相互作用;敲除VDUP-1基因后，小鼠出現(xiàn)低血糖、肝臟脂肪變性、出血等癥狀; VDUP-1表達水平與高血糖和肥胖等有關，參與機體內血糖平衡[16-20]。研究報道顯示，高血糖狀態(tài)下，VDUP-1在腎小管上皮細胞中表達上調，參與糖尿病腎病發(fā)生過程[9, 21]。

Figure 5.The effects of exogenous Shh on Shh signaling pathway in the HK-2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group.

Figure 6.The effects of exogenous Shh and VDUP-1 down-regulation on the apoptosis and TNF-α release of renal tubular epithelial cells induced by high glucose (HG). A: the apoptosis of the cells detected by flow cytometry; B: the changes of the caspase-3 and caspase-9 activities; C: the content of TNF-α in the cell culture supernatant. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs VDUP-1 siRNA+HG group and Shh+HG group.

細胞凋亡與細胞內多種因子的調控有關。Caspase是細胞線粒體凋亡的關鍵蛋白酶，其中caspase-9是caspase級聯(lián)反應的起始因子，是caspase“瀑布式”反應的激活因子，其活化后可以激活線粒體凋亡途徑；caspase-9通常以酶原的形式存在，在凋亡、因子等的刺激下，形成二聚體，激活下游的caspase-3，活化的caspase-3能夠抑制抗凋亡蛋白、DNA修復因子等功能的發(fā)揮，誘導細胞凋亡發(fā)生[22-29]。糖尿病腎病大鼠腎組織中caspase-3和caspase-9的活化水平升高，與腎小管上皮細胞的凋亡有關[30-31]。

本研究中，用高糖刺激腎小管上皮細胞后，腎小管上皮細胞中VDUP-1 mRNA和蛋白水平均明顯升高，同時腎小管上皮凋亡水平升高，細胞中caspase-3和caspase-9活化水平升高，提示高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡，并且促進細胞中VDUP-1表達，這與上述研究報道相符合。用細胞轉染的方法下調腎小管上皮細胞中VDUP-1表達并用高糖刺激后的細胞凋亡率下降，細胞中caspase-3和caspase-9活性降低，提示抑制VDUP-1表達可以抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡。

Shh是一個保守的信號通路，與多個組織和器官的形成有關。Hh配體可以與存在于細胞膜上的受體Ptch結合后，與Smo識別；而Smo是一種跨膜蛋白，可以激活細胞內的信號通路，使存在于細胞漿內的轉錄因子Gli活化以后，進入細胞核內，調控靶基因的轉錄[32-38]。在腎組織發(fā)育成熟以后，Shh信號通路激活水平降低，而在缺血、缺氧等條件下，腎組織中的Shh信號通路被活化，但是在糖尿病腎病發(fā)生后，腎組織中的Shh信號通路被抑制[39-40]。本研究表明，高糖作用后的腎小管上皮細胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh蛋白水平下降，Shh信號通路激活受到抑制；用外源性Shh處理腎小管上皮細胞后，細胞中的Shh信號通路被激活，并且外源性Shh處理VDUP-1表達下調后的腎小管上皮細胞并經(jīng)高糖刺激后，細胞凋亡率下降更多，說明二者具有協(xié)同作用，干擾VDUP-1通過促進Shh信號通路激活而抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡。

以上實驗結果表明，VDUP-1在高糖環(huán)境中的腎小管上皮細胞中表達水平升高，干擾VDUP-1表達可以通過影響Shh信號通路降低高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡水平。VDUP-1參與糖尿病狀態(tài)下的腎小管上皮細胞凋亡，為以后研究糖尿病腎病腎小管上皮細胞凋亡發(fā)生機制提供了科學依據(jù)，為尋找有效靶點治療糖尿病腎病提供了新思路。