KSHV RTA通過上調宿主細胞survivin表達促進病毒子代產生*

高建明， Erle S. ROBERTSON

(1三峽大學醫(yī)學院生理與病理生理學系， 湖北 宜昌 443002；2賓夕法尼亞大學醫(yī)學院微生物學系， 美國 賓夕法尼亞州 費城 19104)

卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又稱γ-皰疹病毒8型，被發(fā)現于1994年，與卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primary effusion lymphoa，PEL)和多中心卡斯特曼病(multicentric Castleman disease)有關[1]。

復制及轉錄激活因子(replication and transcription activator，RTA)是卡波西肉瘤病毒開放閱讀框50編碼的一種即刻早期蛋白，是促使病毒從潛伏性感染向裂解性復制轉變的關鍵調控因子[2]。我們已經報道KSHV RTA能夠增強存活蛋白(survivin)基因啟動子活性，上調宿主細胞的survivin表達[3]， survivin基因啟動子區(qū)域的GC/Sp1和p53順式元件對RTA上調宿主細胞survivin表達具在重要作用[4]。本文進一步探討KSHV RTA介導的survivin表達上調對宿主細胞增殖、凋亡、病毒子代產生及裂解基因表達的影響。

材 料 和 方 法

1 抗體與細胞

抗survivin小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz；抗GAPDH抗體購自Novus Biologicals；偶聯IR Dye 800的羊抗鼠IgG購自Rockland。BJAB為KSHV和EB病毒均陰性的B細胞淋巴瘤細胞系；JSC是感染KSHV的B細胞淋巴瘤細胞系。

2 實驗方法

2.1RNA干擾慢病毒載體的構建 Survivin小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)用shSur表示；對照shRNA(control shRNA)以shC表示；pGIPZ 是一種shRNA慢病毒載體，用來表達survivin shRNA，均購自Open Biosystems。RNA干擾慢病毒載體構建實驗方法已在相關文獻中詳細報告[5]，本研究中，我們構建了JSC-shSur細胞、BJAB-shSur細胞及其對照JSC-shC細胞和BJAB-shC細胞。

2.2Western blot實驗 JSC-shSur細胞、BJAB-shSur細胞及其對照細胞用20 μg/L 12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate， TPA)和1.5 mmol/L butyrate誘導，培養(yǎng)48 h收集細胞，加入RIPA 緩沖液裂解，用Bradford 比色法測定蛋白濃度。取相同質量的細胞裂解液上樣，行SDS-PAGE，轉移蛋白樣品至PVDF膜，分別用抗survivin抗體、抗GAPDH抗體及偶聯IR Dye 800的羊抗鼠IgG II抗進行Western blot實驗。用Odyssey紅外線成像系統(LI-COR Biosciences)觀察結果。

2.3病毒子代DNA的PCR擴增 JSC-shSur細胞及其對照JSC-shC細胞經TPA誘導后培養(yǎng)48 h，離心棄細胞，用0.45 μm 孔徑的過濾器收集上清， 23 500 r/min離心20 min沉淀病毒顆粒。加50 μL 0.2× PBS重懸病毒顆粒，95 ℃ 15 min，加入1 μL 蛋白酶K(10 g/L)于56 ℃孵育1 h，95 ℃ 30 min滅活蛋白酶K。取5 μL 病毒裂解液作模板，PCR擴增KSHV編碼的K9，K9引物見表1。以JSC細胞中分離的KSHV基因組DNA為對照。PCR產物條帶的灰度采用Kodak 1D 3.6軟件定量。

2.4Real-time PCR實驗 JSC-shSur細胞和JSC-shC細胞經TPA誘導后培養(yǎng)24、48和72 h，用TRIzol(Invitrogen)法細胞總RNA抽提，以高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems)逆轉錄合成cDNA。用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(Applied Biosystems)進行PCR 擴增，病毒裂解基因ORF57、TK 及內參照GAPDH的引物序列見表1。10 μL體系含5 μL Master Mix、 1 μL 5 μmol/L的引物和4 μL稀釋的cDNA。反應條件： 95 ℃變性5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72℃ 30 s，30個循環(huán)。每個樣品重復3次。數據采集與分析使用StepOnePlus 實時熒光定量PCR系統(Applied Biosystems)。

表1 PCR擴增引物序列

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞(1×109/L)，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4 ℃過夜。離心棄去固定液，PBS重懸細胞。加入終濃度50 mg/L PI(Sigma)和1 mg/L RNA酶于4 ℃避光染色1 h。用FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測細胞凋亡，采用FlowJo軟件分析數據。每個樣本重復測定6次。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 RTA介導的宿主細胞survivin表達上調促進病毒子代產生

Survivin是調節(jié)細胞凋亡的重要分子，RTA能夠上調survivin表達，因此我們推測RTA介導的survivin表達上調具有抑制宿主細胞的凋亡和促進病毒子代產生的生物學功能。為此，我們應用慢病毒介導的RNA干擾技術構建了survivin抑制的穩(wěn)定細胞株JSC-shSur和BJAB-shSur及其對照細胞JSC-shC和BJAB-shC。Western blot分析證實JSC-shSur細胞和BJAB-shSur細胞的survivin表達水平均比對照組明顯降低,見圖1A。JSC-shSur細胞經TPA誘導后培養(yǎng)48 h，制備細胞的病毒懸液，PCR擴增KSHV 編碼的K9基因，以K9拷貝數代表病毒子代產生水平，結果顯示JSC-shSur細胞的病毒子代產量分別為其2種對照細胞JSC-shC和JSC細胞的1/3和1/9(P<0.05)，見圖1B。這表明RTA能夠利用survivin信號通路促進宿主細胞病毒子的產生。

Figure 1.RTA-mediated survivin up-regulation promoted the production of virus progeny. A: Western blot showed survivin expression in survivin knockdown cells and control cells; B: virus lysates of TRA and butyrate-induced JSC-shC cells and JSC-shSur cells were prepared after induction for 48 h to analyze the production of KSHV progeny by PCR. KSHV genomic DNA isolated from the JSC cells served as control. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC control or JSC-shC-IN group.

2 RTA介導的宿主細胞survivin表達上調促進病毒裂解基因表達

Real-time PCR結果表明，JSC-shSur細胞經TPA誘導后24～72 h，病毒裂解基因ORF57和TK的表達水平逐漸升高，但JSC-shSur細胞2種裂解基因的表達水平在誘導后48 h和72 h均顯著低于survivin表達正常的對照組JSC-shC細胞(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.RTA-mediated survivin up-regulation promoted the expression of KSHV lytic genes. Real-time PCR was used to analyze the ORF57 and TK transcripts in induced and uninduced JSC-shC and JSC-shSur cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC-shC group.

3 RTA介導的宿主細胞survivin表達上調延緩宿主細胞凋亡

KSHV陰性細胞BJAB-shC與BJAB-shSur經TPA誘導24 h，細胞凋亡率分別為7.0%和10.9%；TPA誘導48 h，細胞凋亡率分別為55.0%和57.7%，在相同時點，2種細胞誘導后的凋亡率差異無統計學顯著性。KSHV陽性細胞JSC-shC與JSC-shSur經TPA誘導24 h后細胞凋亡率分別為32.0%和39.6%；TPA誘導48 h的細胞凋亡率分別為74.0%和85.2%。在相同時點，2種細胞誘導后的凋亡率差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Survivin knockdown enhanced the apoptosis of TPA and butyrate-induced KSHV-infected cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs JSC-shC-IN group.

討 論

KSHV存在2種不同的生活周期，即潛伏性感染與裂解性復制[6-7]。病毒在潛伏性感染時以游離體的形式存在，只表達少數潛伏基因；在裂解性復制期，感染性病毒子代釋放，一系列病毒編碼基因以級聯反應的方式激活，調控多種細胞信號轉號通路[2, 8-9]。KSHV陽性細胞經TPA誘導后1 h就可檢出RTA的表達[10]。無論是外源性還是內源性來源引起的RTA表達增高，均可介導病毒裂解性基因的級聯表達[11]。

Survivin是哺乳動物凋亡抑制蛋白家族的一個成員，具有抑制細胞凋亡及參與細胞有絲分裂調控的雙重功能[12]。感染細胞的凋亡是機體抗病毒的一種防御機制；反之，病毒亦可通過多種途徑干擾機體介導的感染細胞的凋亡。我們的前期研究發(fā)現KSHV RTA能夠與survivin基因啟動子結構中的GC/Sp1和p53 順式元件相互作用，上調宿主細胞survivin表達[3-4]。

應用RNA干擾技術抑制survivin表達后， KSHV陽性的JSC細胞經TPA誘導后與對照組細胞相比病毒子產生減少，裂解基因表達下調，凋亡率增加。由此可見RTA介導的survivin表達上調可以延緩宿主細胞的凋亡,促進病毒的裂解性復制，有利于病毒的生存與傳播。